Cosecha de tejido estéril

Lab Animal Research

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Overview

Fuente: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidad de Notre Dame, en

en 1959 la 3 R ' s fueron introducidos por W.M.S. Russell y R.L. Burch en su libro los principios de técnica Experimental humana. 3 R ' s son reemplazo, reducción y refinamiento del uso de animales en investigación. 1 el uso de líneas celulares y cultivos de tejido que se originaron en animales de investigación es una técnica de reemplazo, ya que permite muchos experimentos llevar a cabo en vitro. Recolección de tejidos y órganos para el uso en cultivos celulares y tejidos requiere una técnica aséptica para evitar la contaminación de los tejidos. Cosecha estéril es también necesaria para el análisis de RNA y proteínas y perfiles metabólicos de los tejidos. Este manuscrito será discutir el proceso de cosecha de órgano estéril en ratas y ratones.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Fundamentos de la investigación de animales de laboratorio. Cosecha de tejido estéril. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Principles

< clase p = 'jove_content' > técnica aséptica debe seguirse para asegurar la esterilidad de los tejidos. La cosecha se realiza en una campana de flujo laminar que ha sido desinfectada con alcohol. Todos los materiales deben ser esterilizados. El técnico realiza la cosecha debe don equipo de protección personal, incluyendo una máscara, bouffant, bata quirúrgica estéril y guantes quirúrgicos estériles. El vestido debe cubrir las muñecas para evitar el derramamiento de las células de la piel en la cavidad abierta del cuerpo, en platos de petri o medio estéril. Para mantener la esterilidad del técnico, este procedimiento requiere que un técnico en segundo lugar, no estéril asistir al técnico estéril con la eutanasia de los animales.

en experimentos que requieren los perfiles metabólicos de los tejidos, el método de cosecha de tejido tiene un gran impacto en la calidad de los datos recogidos. 2 ambos euthanasia del procedimiento y la duración de las tomas de la cosecha pueden afectar la integridad de los tejidos. Hipoxia, una consecuencia de la eutanasia con dióxido de carbono, se ha demostrado tener un profundo efecto sobre los metabolitos en los tejidos. Hemorragia de los vasos en el tejido pulmonar es causada también por el uso de dióxido de carbono para la eutanasia. El orden de extracción de tejidos cuando se realiza la disección secuencial de tejidos específicos puede causar cambios metabólicos, como los tejidos comienzan a edad o decaen durante la cosecha.

mientras que las cosechas más estériles como destino un solo órgano, puede haber ocasiones que es necesario más de un órgano. Durante la disección secuencial, los tejidos requeridos determinará el orden en que deben eliminarse. 2 los tejidos que se degradan rápidamente deben cosecharse tan pronto como posible eutanasia siguiente. Para mantener la esterilidad de los instrumentos, órganos de la cavidad abdominal se retiran en el siguiente orden: bazo, hígado, riñón, glándulas suprarrenales, ovarios o testículos, los órganos sexuales accesorios (próstata, vesículas seminales, útero, trompas de Falopio), tejido pancreático, ganglios linfáticos, vejiga urinaria y tracto intestinal (estómago, intestino pequeño y grande). El orden de la cosecha de órganos de la cavidad torácica es primero quitar el corazón y los pulmones seguidos por la colección de timo, los ganglios linfáticos y el esófago. 3 nuevos guantes son necesarios para cada ratón.

< clase p = 'jove_content' > algunos de los órganos cosechados estériles deba conservarse. Preservación de los tejidos se logra flash congelación con nitrógeno líquido (LN 2) o con una combinación de LN 2 y 2-Metilbutano. Para LN 2 solamente, los tejidos son enjuagar con solución salina estéril, borrados en un paño absorbente estéril para agotar el exceso de humedad, colocados en cuadrados de papel de aluminio estéril y sumerge inmediatamente en el LN 2. 2 Para las muestras inmunológicas, se agrega 2-Metilbutano. El tejido está sumergido realmente en el 2-Metilbutano que ha sido enfriado por el LN 2. Cuando los tejidos se han vuelto blancos, se quitan desde el 2-Metilbutano, colocados en envases estériles y colocan directamente en el LN 2.

Procedure

1. preparación

  1. materiales comúnmente usados incluyen alcohol al 70% en un frasco rociador, estériles de 20-25 agujas, dos paquetes de instrumentos estériles de tijeras de iris calibre y pinzas (para la piel) y los tejidos internos del pulgar , toallas, guantes de cirujano estéril, una placa de Petri estéril, medio estéril y solución salina estéril de papel.
  2. El ventilador de la campana debe estar en ejecución durante al menos 15 minutos antes del procedimiento, y deben ser desinfectada con alcohol al 70%.
  3. Si la campana está equipada con una lámpara de esterilización UV, puede utilizarse para desinfectar más la superficie de trabajo.
  4. Limpia guantes para la instalación de la campana. El equipo se carga en la campana en el orden en que se utilizarán, generalmente de izquierda a derecha. Esto permite el trabajo a ser realizado en un flujo de trabajo unidireccional, evitando artículos sucios artículos limpios de contaminación. Esto protegerá el cosechado tejidos u órganos de una contaminación accidental de los cadáveres de animales.
  5. Los paquetes de instrumentos estériles está abiertas, respetando el interior estéril de los paquetes. Para mantener la esterilidad, el paquete se coloca en el centro de la mesa, y cada aleta se abre sin cruzar sobre el campo estéril o el interior del paquete. La persona no estéril abre la solapa superior primera reflejando lejos de él. Las aletas laterales se abren entonces con ambas manos una en cada aleta- y tirando lejos el paquete. La aleta final luego se tira hacia la persona abre el paquete, teniendo cuidado de evitar tocar cualquiera de las superficies internas del paquete.
  6. Colocar las toallas de papel en la campana y mojado con alcohol.
  7. La persona no estéril eutanasia a los animales.
  8. La persona estéril lleva dos juegos de guantes quirúrgicos estériles.
  9. La persona estéril coloca el cadáver en las toallas de papel y empapa completamente el cadáver con alcohol al 70%.
  10. Usando un sistema de tijeras estériles y pinzas, hacer un corte horizontal en la piel anterior a la del prepucio (en hombres) o el hueso pélvico (en las hembras). Evitar cortar a través de la musculatura abdominal.
  11. Dejar de lado los instrumentos de.

2. Recolección de tejidos

  1. hacer un pequeño corte justo anterior a la pelvis en las hembras y por encima del prepucio en los machos.
  2. Coloque el pulgar bajo el corte y sujete el borde craneal del corte. Con la otra mano, sujetar las extremidades traseras y la cola tirando la piel hacia la cabeza.
  3. La piel se rasgan lejos del cuerpo justo encima de los miembros posteriores y puede ser el revés sobre la cabeza y patas delanteras. Esto efectivamente elimina contaminantes de pelo durante la cosecha de órganos.
  4. Remojar el cuerpo otra vez con alcohol al 70% y quitar el superficial par de guantes que no son estériles.
  5. Abrir la cavidad abdominal utilizando instrumentos estériles.
    1. Bazo
      1. para cosechar el bazo, el cuerpo se coloca en el lateral derecho recumbency.
      2. El bazo puede visualizarse a través del músculo abdominal.
      3. Un corte de tijera se hace directamente sobre el bazo.
      4. El bazo se retrae cuidadosamente de la cavidad del cuerpo.
      5. Cuando se cortan todos los accesorios entre el bazo, el estómago y el tejido pancreático, evitar pinchar o rasgar el órgano.
    2. Hígado
      1. para cosechar cualquier otros órganos abdominales, el cuerpo es colocado en dorsal recumbency.
      2. El músculo abdominal se levanta y se corta, dejando un óvalo de apertura directamente en la cavidad abdominal.
      3. Después de exponer la cavidad abdominal, reflejar el hígado caudalmente del diafragma.
      4. Sever cuidadosamente cualquier membranas adjuntando el hígado al diafragma de la.
      5. Hacer un corte perpendicular a la espina dorsal a través de los vasos sanguíneos visible entre el hígado y el diafragma.
      6. Levantar el hígado y reflejan hacia el diafragma para visualizar los archivos adjuntos debajo de lo
      7. Habrá finas membranas adjuntando los pequeños lóbulos de hígado en el estómago y el intestino delgado, que tendrá que ser interrumpido.
      8. Agarre el nodo fibroso en el centro del hígado en su parte inferior y levantar el órgano para encontrar todos los accesorios. Separar el hígado de los órganos y los tejidos subyacentes.
      9. En cuenta que el hígado es frágil y puede perforarse fácilmente, resultando en la liberación de la sangre; por lo tanto, debe ser manipulado con cuidado.
    3. Riñones
      1. después de exponer la cavidad abdominal, empujar los intestinos hacia la izquierda para visualizar el riñón derecho, o a la derecha para visualizar el riñón izquierdo.
      2. Para extraer el riñón, utilice pinzas captar bajo el riñón para aislar el órgano del cuerpo. Con unas tijeras o una cuchilla de bisturí, corte el riñón fuera del cuerpo. Hacer el corte bajo el fórceps para evitar dañar el riñón.
      3. Una vez que se extirpa el riñón, grasa puede cortarse del órgano.
    4. Ovario
      1. después de exponer la cavidad abdominal, mover los intestinos cranially para visualizar útero.
      2. Seguir la izquierda y luego la derecha, cuernos del útero a los ovarios.
      3. Los ovarios son pequeños. En animales más viejos, pueden ser incrustados en grasa.
      4. Deslice el fórceps bajo el ovario para aislar el cuerpo y corte libre de la grasa y la trompa de Falopio.
    5. Testículos
      1. después de abrir la cavidad abdominal, sujete la almohadilla de grasa inguinal y tire suavemente lo anterior.
      2. Esto tirará el testículo del escroto.
      3. Una vez que se expone el testículo, cortar los accesorios para el escroto y el conducto deferente para liberar del cuerpo.
      4. Esto se hace para cada testículo.
  6. La cavidad torácica se abre para extraer los órganos torácicos
    1. el cuerpo es colocado en recumbency dorsal. Es imprescindible que la piel se refleja muy por encima de la cabeza si son órganos de la cavidad torácica para cosechar.
    2. Tome el proceso de xiphoid y elevación para permitir un corte a través del músculo abdominal justo caudal a las costillas. Ampliar el corte a lo largo de la curva inferior de la caja torácica a ambos lados. Esto permitirá que la visualización del diafragma.
    3. Perforar el diafragma haciendo un pequeño corte en la caja torácica punto a lo más lateral posible en cada lado. Cortar la membrana de las costillas.
    4. Elevar las costillas en el xifoides para visualizar los órganos torácicos.
    5. Extender el corte lateral en la parte superior del esternón en ambos lados y abre el cofre.
    6. El corazón y los pulmones se quita más fácilmente juntos.
      1. Coloca la pinza perpendicular a la tráquea y sujete firmemente la tráquea.
      2. Con las tijeras, realizar un corte perpendicular a la tráquea justo anterior a las pinzas. Este corte debe cortar la tráquea y el esófago.
      3. Sin aflojar la empuñadura en la tráquea, levante la tráquea hasta y caudalmente. Cortar cualquier accesorio de los pulmones a la superficie de la columna vertebral en la caja torácica.
      4. El esófago puede necesitar ser cortado para poder levantar el corazón y los pulmones libres de la cavidad torácica.
    7. Corazón sólo
      1. levantar el corazón y corte cuidadosamente a través del saco pericárdico.
      2. La aorta es en el aspecto craneal del corazón en los animales & #39; s hacia la izquierda.
      3. Sosteniendo la aorta con las pinzas, hacer un corte distal para el fórceps, conservando un asimiento en la aorta y el corazón.
      4. Agarre la aorta como se separa la anterior de la vena cava, arterias pulmonares y las venas.
      5. Levantar el corazón libre de la cavidad torácica por la arteria aorta.
    8. Otros órganos torácicos
      1. órganos son cosechados en el siguiente orden para mantener la esterilidad de los instrumentos: timo, ganglios linfáticos y el esófago.
  7. Cerebro
    1. en circunstancias especiales, el cerebro tendrá que cosechar cultura estéril.
    2. El cerebro se cosecha última después de las cosechas de cualquier otro órgano.
    3. En casos donde el cerebro es el único órgano que debe recogerse, la piel no esté despojada del cuerpo, pero en su lugar un corte se hace en la nuca del cuello y extiende a lo largo de la línea media de la zona cervical dorsal hasta la punta de la nariz.
    4. Después de tirar lateralmente la piel del cráneo, el hueso expuesto es empapado con alcohol al 70% y se quitan los guantes sucios superior.
    5. Con un dedicado cerebro estéril tijeras de cosecha, hacer un corte a través de la columna vertebral en la base del cráneo.
    6. Abrir el cráneo colocando el punto de las tijeras en el foramen magnum y corte a lo largo de la línea media.
    7. Utilizar el extremo plano de la hoja de tijera de palanca de los huesos parietales del cerebro.
    8. Interrumpir cuidadosamente los accesorios del nervio en el tronco cerebral y el quiasma óptico debajo del cerebro, usando la punta cerrada de fórceps del pulgar.
    9. De manera similar, deslice la pinza cerrada anterior debajo del cerebro y romper los accesorios en los bulbos olfativos.
    10. El cerebro puede descartarse luego del cráneo en medio estéril.
    11. Cuando se cosecha el cerebro, una mano se considerará no estéril como agarra la piel del cráneo reflejadas debajo de la barbilla para estabilizar la cabeza, mientras que el cráneo se corta y el cerebro quitado.
  8. Piel
    1. tejido mamario
      1. tejido mamario se encuentra entre la parte superior del esternón en el manubrio y la apertura genital en la superficie ventral y se extiende lateralmente a ambos lados, tocando casi en la superficie dorsal de la cadera y el shou lders.
      2. Examinar el tejido mamario para buscar masas, decoloración o anormalidades. Mujeres lactantes o embarazadas habrá aumentado el volumen de tejido mamario, y la leche puede estar presente.
      3. La supresión de las glándulas mamarias requiere agarrando el borde de la glándula con el fórceps del pulgar y utilizando disección Roma para aflojar los archivos adjuntos a la piel. Una vez que la glándula se ha separado de la piel, tijeras de iris se pueden utilizar para cortar los restantes adjuntos.
      4. Remojar las superficies expuestas con alcohol al 70% y comenzar la cosecha de tejidos usando un nuevo conjunto de instrumentos estériles.
      5. El tejido recolectado, se enjuaga con solución salina estéril antes de colocar en medio de cultivo.
    2. Tumores subcutáneos
      1. a menudo, las células tumorales son repetidamente implantadas en animales, y luego el tumor resultante se cosecha para mantener la línea de celular del tumor.
      2. Es imperativo realizar cosecha de tumores subcutáneos de tejido estéril antes de la ruptura de la piel ' integridad de s.
      3. Si la masa ha desgastado o necrótica, el tejido recogido no será de buena calidad y puede que no sea estéril.
      4. Del cuerpo está posicionada para exponer el área de interés. La piel se corta a lo largo de un lado del tumor.
      5. Reflejan cuidadosamente la piel para exponer el tumor. Colocar los instrumentos de la piel a un lado y disfrutar de los tejidos expuestos con alcohol al 70%.
      6. Con nuevos instrumentos estériles, diseccionar la masa de los accesorios subyacentes y cortar cualquier vasos sanguíneos alimentando la Misa.
      7. El tumor se coloca en medio de cultivo.

demandan de muchos experimentos de colección de las células del tejido suprimido. En tales casos, es imprescindible realizar el procedimiento de recolección de tejido de forma estéril. El uso de líneas celulares y cultivos de tejidos que se originan en animales de investigación permite muchos experimentos ser realizados en vitro, whichin a su vez reduce el uso de animales en investigación.

En este video, vamos a discutir el método aséptico para la cosecha de órganos comúnmente extraídos de animales de laboratorio. Y esto será seguido por una breve revisión de algunos experimentos de ejemplo empleando esta técnica estéril para lograr objetivos de investigación diferentes.

que ' s comenzar con los pasos preparar necesarios para garantizar la esterilidad del espacio, instrumentos, personal y durante la cosecha de tejidos animales.

Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Antes del proceso, el ventilador de la campana debe funcionar durante al menos 15 minutos y la zona debe ser desinfectada con alcohol al 70%. Luego, colocar algunas toallas de papel en la campana y mojado con etanol al 70%. Después de eso, el equipo estéril de la carga y organiza por el orden en el que cada instrumento se utilizará, generalmente de izquierda a derecha. Esto permite que el flujo de trabajo en forma unidireccional, prevención de la contaminación accidental de la canal de animales.

Se recomienda que un técnico no estériles se presenta para ayudar al técnico estéril. Ambos operadores deben llevar una máscara y un bouffant. El técnico estéril debe ponga una bata estéril y dos pares de guantes quirúrgicos estériles. Nota que el vestido y los guantes deben cubrir las muñecas para evitar el derramamiento de las células de la piel en la cavidad abierta del cuerpo, en platos de petri o medios estériles.

La persona no estéril abre el paquete estéril instrumento sin tocar la superficie interna, por lo que la persona estéril puede quitar la herramienta de forma aséptica. Por último, el técnico no estéril euthanizes animal, coloca el cadáver en las toallas de papel y totalmente empapa con alcohol al 70%, por lo que la persona estéril puede comenzar la cosecha.

en primer lugar, revisaremos la extracción de los órganos abdominales, incluyendo el bazo, hígado, riñones, ovarios y testículos.

Usando un sistema de tijeras estériles y pinza hacer un corte horizontal en la piel justo anterior del prepucio en los machos y el hueso pélvico en las mujeres. Evitar cortar a través de la musculatura abdominal. A continuación, coloque su dedo pulgar bajo el corte y sujete el borde craneal del corte. Con la otra mano, sujetar las extremidades traseras y la cola, tirando la piel hacia la cabeza. La piel se rasgan lejos del cuerpo justo encima de los miembros posteriores y puede ser el revés sobre la cabeza y patas delanteras. Esto efectivamente elimina contaminantes de cabello que puedan interferir con la cosecha de órgano estéril. Luego, sumerja el cuerpo otra vez con alcohol al 70% y quitar el superficial par de guantes, que no son estériles. También Deseche todos los instrumentos que se utilizaron en la piel.

a la cosecha el bazo, posición del cuerpo en recumbency lateral derecho. THbazo e debe ser visible a través del músculo abdominal. Utilice tijeras para hacer un corte directamente sobre el bazo y retraer suavemente el órgano de la cavidad del cuerpo. Cortar todos los accesorios entre el bazo y el estómago y el tejido pancreático, pero evitar pinchar o rasgar el órgano.

a todos los otros órganos abdominales, coloque el cuerpo en recumbency dorsal. Luego, levante y corte el músculo abdominal dejando un óvalo de apertura directamente en la cavidad abdominal. Para cosechar el hígado, reflejan el órgano caudalmente de la membrana. Ahora utilice tijeras para cortar cuidadosamente cualquier membranas entre las dos estructuras. A continuación, hacer un corte perpendicular a la espina dorsal a través de los vasos sanguíneos. Luego levantar el hígado y reflejan hacia el diafragma para visualizar los archivos adjuntos debajo de él. Habrá finas membranas adjuntando los pequeños lóbulos de hígado en el estómago y el intestino delgado. Sujete el nodo fibroso en el centro del hígado en la parte inferior y el órgano para encontrar todos los accesorios de Levante. Ahora separar el órgano de los tejidos subyacentes. Tenga en cuenta que el hígado es frágil y puede perforarse fácilmente dando por resultado la liberación excesiva de la sangre. Por lo tanto, debe ser manipulado con cuidado.

a los riñones, empujar los intestinos a la izquierda para exponer el riñón derecho o a la derecha para descubrir el riñón izquierdo. Ahora uso las cuchillas pinza agarrar bajo el riñón y con unas tijeras cortadas bajo el fórceps, extracción del órgano del cuerpo.

Mover los intestinos cranially a visualizar el útero a los ovarios. Siga a la izquierda y los cuernos uterinos derecho a los ovarios. Estos son órganos pequeños y en animales más viejos pueden ser incrustados en la grasa. Deslice la pinza bajo el ovario fin de aislarlo del cuerpo libre de la grasa y la trompa de Falopio.

En los machos, para quitar los testículos, sujete la almohadilla de grasa inguinal y tire suavemente hacia delante. Esto tirará el testículo del escroto. Una vez que llegan a ser visibles, cortar los accesorios para el escroto y el conducto deferente a estas estructuras del cuerpo.

a continuación, deje que ' s aprender a cosechar órganos torácicos, tales como el corazón y los pulmones. El corazón y los pulmones se quitan más fácilmente juntos. Para abrir la cavidad torácica, comience por colocar el animal en recumbency dorsal. En primer lugar, sujete y levante el proceso del xiphoid. Luego realizar un corte a través del músculo abdominal caudal justo en las costillas. Ampliar el corte a lo largo de la curva inferior de la caja torácica a ambos lados, exponiendo la membrana.

a continuación, perfore el diafragma haciendo un pequeño corte en la caja torácica punto a lo más lateral posible en cada lado. Luego, se corta el diafragma de las costillas. Ahora levantar las costillas en el xifoides para visualizar los órganos torácicos. Extender los laterales cortar la parte superior del esternón en ambos lados para abrir el cofre. Luego coloca la pinza perpendicular a la tráquea y sujete firmemente la tráquea. Ahora, usando las tijeras, realice un corte perpendicular a anterior el fórceps. Esto debería cortar la tráquea y el esófago. Sin aflojar el apretón en la tráquea, levante caudalmente y cortar cualquier accesorio de los pulmones a la superficie de la columna vertebral en la caja torácica. Continúe hasta que usted es capaz de levantar el corazón y los pulmones libres de la cavidad torácica.

Para eliminar sólo el corazón, el órgano de Levante y corte cuidadosamente a través del saco pericárdico. A continuación, sostenga la aorta con las pinzas y hacer un corte distal a las pinzas. Luego separa el anterior de la vena cava, arterias pulmonares y las venas. Después de eso, usted debe ser capaz de levantar el corazón libre de la cavidad torácica.

, pues ' s revisar el procedimiento de recolección el cerebro mediante una técnica aséptica. En casos donde el cerebro es el único órgano que se recogerá, el preparar pasos son los mismos.

Para iniciar la cosecha, saturar el cuerpo con alcohol y tira de la piel del cuerpo como antes, encima y sobre el cráneo. Esto permite que todo sea estéril desde este punto hacia adelante. Entonces, saturar el animal con el alcohol, retire los guantes exteriores y desechar los instrumentos utilizados en la piel. Ahora hacer un corte en la nuca del cuello y extenderlo a lo largo de la línea media de la zona cervical dorsal hasta la punta de la nariz.

Ahora, con una dedicada cerebro estéril tijeras de cosecha, hacer un corte a través de la columna vertebral en la base del cráneo. Para abrir el cráneo, coloque la punta de las tijeras en el foramen magnum y corte a lo largo de la línea media. Tenga en cuenta que durante este procedimiento de cerebro, una mano se considera no estéril como agarra la piel del cráneo refleja debajo de la barbilla a la cabeza, mientras la mano estéril se utiliza para cortar el cráneo. Después de eso, utilice el borde plano de la hoja de tijera de palanca de los huesos parietales del cerebro. Y con cuidado utilizando la espátula, interrumpir los accesorios del nervio en el tronco cerebral y el quiasma óptico, debajo del cerebro. Por último, deslice la pinza cerrada anterior y romper los accesorios en los bulbos olfativos. Y el cerebro puede entonces ser caído del cráneo directamente los medios estériles.

ahora que ' ve revisó los elementos esenciales de la cosecha de tejido estéril, que ' s discutir algunas de las muchas aplicaciones de este procedimiento en la investigación biomédica.

Vástago neuronales los investigadores utilizan una técnica recolección estéril para extraer tejido del cerebro neonatal ratón, crecer estas células en vitro. Esto les permite estudiar el papel de las células madre neurales en el desarrollo y progresión del cáncer de.

Otra área activa de investigación que implica la cosecha de tejido es perfilado metabólico, que implica estudiar la fisiología del tejido mediante el análisis de los diferentes metabolitos en una muestra. En este ejemplo, los científicos, usando una técnica aséptica, recogió las biopsias del hígado de tipo salvaje y ratones libres de gérmenes y utiliza la espectroscopia de resonancia magnética nuclear, o RMN, para aclarar la diferencia en el perfil metabólico hepático de las dos poblaciones de animales.

Por último, los inmunólogos a menudo realizan cosecha de tejido estéril para estudiar la propagación de la infección. En este experimento particular, investigadores realizaron inyección intratraqueal de la bacteria Pseudomonas aeruginosa para inducir la infección pulmonar crónica. A continuación, los animales fueron sacrificados y los pulmones fueron extraídos usando una técnica aséptica para determinar la carga bacteriana en 3, 7, 14 y 28 días post-infección.

te ' ve a Miró JoVE ' s video sobre recolección de tejidos procedentes de animales de laboratorio mediante una técnica aséptica. Ahora debería tener una mejor idea de los pasos que debe tomar para asegurarse de que la esterilidad se mantiene a través de la cosecha. Y debería poder extraer órganos abdominales y torácicos los cerebros de estos animales sin causar ningún daño al tejido. Como siempre, gracias por ver!

Summary

< clase p = 'jove_content' > aunque muchos de los procedimientos para la cosecha de órganos estériles son similares a una necropsia estándar, el uso de la técnica estéril es imperativo para los tejidos de valor para los procedimientos experimentales, que incluyen las células de la suprimido los tejidos. Perfiles o recolección de RNA de tejidos puede verse comprometida si no se mantiene la esterilidad.

References

  1. Russel, W.M.S. and Burch, R.L. 1959. The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen: London.
  2. Petucci, C., Rojas-Betancourt, S., and Gardell, S.J. 2012. Comparison of tissue harvest protocols for the quantitation of acylcarnitines in mouse heart and liver by mass spectrometry. Metabolomics. 8.784-792.
  3. Parkinson, C.M., O'Brien, A., Albers, T.M., Simon, M.A., Clifford, C.B., and Pritchett-Corning, K.R. 2011. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. 54. e2966. 1-7.

1. preparación

  1. materiales comúnmente usados incluyen alcohol al 70% en un frasco rociador, estériles de 20-25 agujas, dos paquetes de instrumentos estériles de tijeras de iris calibre y pinzas (para la piel) y los tejidos internos del pulgar , toallas, guantes de cirujano estéril, una placa de Petri estéril, medio estéril y solución salina estéril de papel.
  2. El ventilador de la campana debe estar en ejecución durante al menos 15 minutos antes del procedimiento, y deben ser desinfectada con alcohol al 70%.
  3. Si la campana está equipada con una lámpara de esterilización UV, puede utilizarse para desinfectar más la superficie de trabajo.
  4. Limpia guantes para la instalación de la campana. El equipo se carga en la campana en el orden en que se utilizarán, generalmente de izquierda a derecha. Esto permite el trabajo a ser realizado en un flujo de trabajo unidireccional, evitando artículos sucios artículos limpios de contaminación. Esto protegerá el cosechado tejidos u órganos de una contaminación accidental de los cadáveres de animales.
  5. Los paquetes de instrumentos estériles está abiertas, respetando el interior estéril de los paquetes. Para mantener la esterilidad, el paquete se coloca en el centro de la mesa, y cada aleta se abre sin cruzar sobre el campo estéril o el interior del paquete. La persona no estéril abre la solapa superior primera reflejando lejos de él. Las aletas laterales se abren entonces con ambas manos una en cada aleta- y tirando lejos el paquete. La aleta final luego se tira hacia la persona abre el paquete, teniendo cuidado de evitar tocar cualquiera de las superficies internas del paquete.
  6. Colocar las toallas de papel en la campana y mojado con alcohol.
  7. La persona no estéril eutanasia a los animales.
  8. La persona estéril lleva dos juegos de guantes quirúrgicos estériles.
  9. La persona estéril coloca el cadáver en las toallas de papel y empapa completamente el cadáver con alcohol al 70%.
  10. Usando un sistema de tijeras estériles y pinzas, hacer un corte horizontal en la piel anterior a la del prepucio (en hombres) o el hueso pélvico (en las hembras). Evitar cortar a través de la musculatura abdominal.
  11. Dejar de lado los instrumentos de.

2. Recolección de tejidos

  1. hacer un pequeño corte justo anterior a la pelvis en las hembras y por encima del prepucio en los machos.
  2. Coloque el pulgar bajo el corte y sujete el borde craneal del corte. Con la otra mano, sujetar las extremidades traseras y la cola tirando la piel hacia la cabeza.
  3. La piel se rasgan lejos del cuerpo justo encima de los miembros posteriores y puede ser el revés sobre la cabeza y patas delanteras. Esto efectivamente elimina contaminantes de pelo durante la cosecha de órganos.
  4. Remojar el cuerpo otra vez con alcohol al 70% y quitar el superficial par de guantes que no son estériles.
  5. Abrir la cavidad abdominal utilizando instrumentos estériles.
    1. Bazo
      1. para cosechar el bazo, el cuerpo se coloca en el lateral derecho recumbency.
      2. El bazo puede visualizarse a través del músculo abdominal.
      3. Un corte de tijera se hace directamente sobre el bazo.
      4. El bazo se retrae cuidadosamente de la cavidad del cuerpo.
      5. Cuando se cortan todos los accesorios entre el bazo, el estómago y el tejido pancreático, evitar pinchar o rasgar el órgano.
    2. Hígado
      1. para cosechar cualquier otros órganos abdominales, el cuerpo es colocado en dorsal recumbency.
      2. El músculo abdominal se levanta y se corta, dejando un óvalo de apertura directamente en la cavidad abdominal.
      3. Después de exponer la cavidad abdominal, reflejar el hígado caudalmente del diafragma.
      4. Sever cuidadosamente cualquier membranas adjuntando el hígado al diafragma de la.
      5. Hacer un corte perpendicular a la espina dorsal a través de los vasos sanguíneos visible entre el hígado y el diafragma.
      6. Levantar el hígado y reflejan hacia el diafragma para visualizar los archivos adjuntos debajo de lo
      7. Habrá finas membranas adjuntando los pequeños lóbulos de hígado en el estómago y el intestino delgado, que tendrá que ser interrumpido.
      8. Agarre el nodo fibroso en el centro del hígado en su parte inferior y levantar el órgano para encontrar todos los accesorios. Separar el hígado de los órganos y los tejidos subyacentes.
      9. En cuenta que el hígado es frágil y puede perforarse fácilmente, resultando en la liberación de la sangre; por lo tanto, debe ser manipulado con cuidado.
    3. Riñones
      1. después de exponer la cavidad abdominal, empujar los intestinos hacia la izquierda para visualizar el riñón derecho, o a la derecha para visualizar el riñón izquierdo.
      2. Para extraer el riñón, utilice pinzas captar bajo el riñón para aislar el órgano del cuerpo. Con unas tijeras o una cuchilla de bisturí, corte el riñón fuera del cuerpo. Hacer el corte bajo el fórceps para evitar dañar el riñón.
      3. Una vez que se extirpa el riñón, grasa puede cortarse del órgano.
    4. Ovario
      1. después de exponer la cavidad abdominal, mover los intestinos cranially para visualizar útero.
      2. Seguir la izquierda y luego la derecha, cuernos del útero a los ovarios.
      3. Los ovarios son pequeños. En animales más viejos, pueden ser incrustados en grasa.
      4. Deslice el fórceps bajo el ovario para aislar el cuerpo y corte libre de la grasa y la trompa de Falopio.
    5. Testículos
      1. después de abrir la cavidad abdominal, sujete la almohadilla de grasa inguinal y tire suavemente lo anterior.
      2. Esto tirará el testículo del escroto.
      3. Una vez que se expone el testículo, cortar los accesorios para el escroto y el conducto deferente para liberar del cuerpo.
      4. Esto se hace para cada testículo.
  6. La cavidad torácica se abre para extraer los órganos torácicos
    1. el cuerpo es colocado en recumbency dorsal. Es imprescindible que la piel se refleja muy por encima de la cabeza si son órganos de la cavidad torácica para cosechar.
    2. Tome el proceso de xiphoid y elevación para permitir un corte a través del músculo abdominal justo caudal a las costillas. Ampliar el corte a lo largo de la curva inferior de la caja torácica a ambos lados. Esto permitirá que la visualización del diafragma.
    3. Perforar el diafragma haciendo un pequeño corte en la caja torácica punto a lo más lateral posible en cada lado. Cortar la membrana de las costillas.
    4. Elevar las costillas en el xifoides para visualizar los órganos torácicos.
    5. Extender el corte lateral en la parte superior del esternón en ambos lados y abre el cofre.
    6. El corazón y los pulmones se quita más fácilmente juntos.
      1. Coloca la pinza perpendicular a la tráquea y sujete firmemente la tráquea.
      2. Con las tijeras, realizar un corte perpendicular a la tráquea justo anterior a las pinzas. Este corte debe cortar la tráquea y el esófago.
      3. Sin aflojar la empuñadura en la tráquea, levante la tráquea hasta y caudalmente. Cortar cualquier accesorio de los pulmones a la superficie de la columna vertebral en la caja torácica.
      4. El esófago puede necesitar ser cortado para poder levantar el corazón y los pulmones libres de la cavidad torácica.
    7. Corazón sólo
      1. levantar el corazón y corte cuidadosamente a través del saco pericárdico.
      2. La aorta es en el aspecto craneal del corazón en los animales & #39; s hacia la izquierda.
      3. Sosteniendo la aorta con las pinzas, hacer un corte distal para el fórceps, conservando un asimiento en la aorta y el corazón.
      4. Agarre la aorta como se separa la anterior de la vena cava, arterias pulmonares y las venas.
      5. Levantar el corazón libre de la cavidad torácica por la arteria aorta.
    8. Otros órganos torácicos
      1. órganos son cosechados en el siguiente orden para mantener la esterilidad de los instrumentos: timo, ganglios linfáticos y el esófago.
  7. Cerebro
    1. en circunstancias especiales, el cerebro tendrá que cosechar cultura estéril.
    2. El cerebro se cosecha última después de las cosechas de cualquier otro órgano.
    3. En casos donde el cerebro es el único órgano que debe recogerse, la piel no esté despojada del cuerpo, pero en su lugar un corte se hace en la nuca del cuello y extiende a lo largo de la línea media de la zona cervical dorsal hasta la punta de la nariz.
    4. Después de tirar lateralmente la piel del cráneo, el hueso expuesto es empapado con alcohol al 70% y se quitan los guantes sucios superior.
    5. Con un dedicado cerebro estéril tijeras de cosecha, hacer un corte a través de la columna vertebral en la base del cráneo.
    6. Abrir el cráneo colocando el punto de las tijeras en el foramen magnum y corte a lo largo de la línea media.
    7. Utilizar el extremo plano de la hoja de tijera de palanca de los huesos parietales del cerebro.
    8. Interrumpir cuidadosamente los accesorios del nervio en el tronco cerebral y el quiasma óptico debajo del cerebro, usando la punta cerrada de fórceps del pulgar.
    9. De manera similar, deslice la pinza cerrada anterior debajo del cerebro y romper los accesorios en los bulbos olfativos.
    10. El cerebro puede descartarse luego del cráneo en medio estéril.
    11. Cuando se cosecha el cerebro, una mano se considerará no estéril como agarra la piel del cráneo reflejadas debajo de la barbilla para estabilizar la cabeza, mientras que el cráneo se corta y el cerebro quitado.
  8. Piel
    1. tejido mamario
      1. tejido mamario se encuentra entre la parte superior del esternón en el manubrio y la apertura genital en la superficie ventral y se extiende lateralmente a ambos lados, tocando casi en la superficie dorsal de la cadera y el shou lders.
      2. Examinar el tejido mamario para buscar masas, decoloración o anormalidades. Mujeres lactantes o embarazadas habrá aumentado el volumen de tejido mamario, y la leche puede estar presente.
      3. La supresión de las glándulas mamarias requiere agarrando el borde de la glándula con el fórceps del pulgar y utilizando disección Roma para aflojar los archivos adjuntos a la piel. Una vez que la glándula se ha separado de la piel, tijeras de iris se pueden utilizar para cortar los restantes adjuntos.
      4. Remojar las superficies expuestas con alcohol al 70% y comenzar la cosecha de tejidos usando un nuevo conjunto de instrumentos estériles.
      5. El tejido recolectado, se enjuaga con solución salina estéril antes de colocar en medio de cultivo.
    2. Tumores subcutáneos
      1. a menudo, las células tumorales son repetidamente implantadas en animales, y luego el tumor resultante se cosecha para mantener la línea de celular del tumor.
      2. Es imperativo realizar cosecha de tumores subcutáneos de tejido estéril antes de la ruptura de la piel ' integridad de s.
      3. Si la masa ha desgastado o necrótica, el tejido recogido no será de buena calidad y puede que no sea estéril.
      4. Del cuerpo está posicionada para exponer el área de interés. La piel se corta a lo largo de un lado del tumor.
      5. Reflejan cuidadosamente la piel para exponer el tumor. Colocar los instrumentos de la piel a un lado y disfrutar de los tejidos expuestos con alcohol al 70%.
      6. Con nuevos instrumentos estériles, diseccionar la masa de los accesorios subyacentes y cortar cualquier vasos sanguíneos alimentando la Misa.
      7. El tumor se coloca en medio de cultivo.

demandan de muchos experimentos de colección de las células del tejido suprimido. En tales casos, es imprescindible realizar el procedimiento de recolección de tejido de forma estéril. El uso de líneas celulares y cultivos de tejidos que se originan en animales de investigación permite muchos experimentos ser realizados en vitro, whichin a su vez reduce el uso de animales en investigación.

En este video, vamos a discutir el método aséptico para la cosecha de órganos comúnmente extraídos de animales de laboratorio. Y esto será seguido por una breve revisión de algunos experimentos de ejemplo empleando esta técnica estéril para lograr objetivos de investigación diferentes.

que ' s comenzar con los pasos preparar necesarios para garantizar la esterilidad del espacio, instrumentos, personal y durante la cosecha de tejidos animales.

Este procedimiento se realiza en una campana de flujo laminar. Antes del proceso, el ventilador de la campana debe funcionar durante al menos 15 minutos y la zona debe ser desinfectada con alcohol al 70%. Luego, colocar algunas toallas de papel en la campana y mojado con etanol al 70%. Después de eso, el equipo estéril de la carga y organiza por el orden en el que cada instrumento se utilizará, generalmente de izquierda a derecha. Esto permite que el flujo de trabajo en forma unidireccional, prevención de la contaminación accidental de la canal de animales.

Se recomienda que un técnico no estériles se presenta para ayudar al técnico estéril. Ambos operadores deben llevar una máscara y un bouffant. El técnico estéril debe ponga una bata estéril y dos pares de guantes quirúrgicos estériles. Nota que el vestido y los guantes deben cubrir las muñecas para evitar el derramamiento de las células de la piel en la cavidad abierta del cuerpo, en platos de petri o medios estériles.

La persona no estéril abre el paquete estéril instrumento sin tocar la superficie interna, por lo que la persona estéril puede quitar la herramienta de forma aséptica. Por último, el técnico no estéril euthanizes animal, coloca el cadáver en las toallas de papel y totalmente empapa con alcohol al 70%, por lo que la persona estéril puede comenzar la cosecha.

en primer lugar, revisaremos la extracción de los órganos abdominales, incluyendo el bazo, hígado, riñones, ovarios y testículos.

Usando un sistema de tijeras estériles y pinza hacer un corte horizontal en la piel justo anterior del prepucio en los machos y el hueso pélvico en las mujeres. Evitar cortar a través de la musculatura abdominal. A continuación, coloque su dedo pulgar bajo el corte y sujete el borde craneal del corte. Con la otra mano, sujetar las extremidades traseras y la cola, tirando la piel hacia la cabeza. La piel se rasgan lejos del cuerpo justo encima de los miembros posteriores y puede ser el revés sobre la cabeza y patas delanteras. Esto efectivamente elimina contaminantes de cabello que puedan interferir con la cosecha de órgano estéril. Luego, sumerja el cuerpo otra vez con alcohol al 70% y quitar el superficial par de guantes, que no son estériles. También Deseche todos los instrumentos que se utilizaron en la piel.

a la cosecha el bazo, posición del cuerpo en recumbency lateral derecho. THbazo e debe ser visible a través del músculo abdominal. Utilice tijeras para hacer un corte directamente sobre el bazo y retraer suavemente el órgano de la cavidad del cuerpo. Cortar todos los accesorios entre el bazo y el estómago y el tejido pancreático, pero evitar pinchar o rasgar el órgano.

a todos los otros órganos abdominales, coloque el cuerpo en recumbency dorsal. Luego, levante y corte el músculo abdominal dejando un óvalo de apertura directamente en la cavidad abdominal. Para cosechar el hígado, reflejan el órgano caudalmente de la membrana. Ahora utilice tijeras para cortar cuidadosamente cualquier membranas entre las dos estructuras. A continuación, hacer un corte perpendicular a la espina dorsal a través de los vasos sanguíneos. Luego levantar el hígado y reflejan hacia el diafragma para visualizar los archivos adjuntos debajo de él. Habrá finas membranas adjuntando los pequeños lóbulos de hígado en el estómago y el intestino delgado. Sujete el nodo fibroso en el centro del hígado en la parte inferior y el órgano para encontrar todos los accesorios de Levante. Ahora separar el órgano de los tejidos subyacentes. Tenga en cuenta que el hígado es frágil y puede perforarse fácilmente dando por resultado la liberación excesiva de la sangre. Por lo tanto, debe ser manipulado con cuidado.

a los riñones, empujar los intestinos a la izquierda para exponer el riñón derecho o a la derecha para descubrir el riñón izquierdo. Ahora uso las cuchillas pinza agarrar bajo el riñón y con unas tijeras cortadas bajo el fórceps, extracción del órgano del cuerpo.

Mover los intestinos cranially a visualizar el útero a los ovarios. Siga a la izquierda y los cuernos uterinos derecho a los ovarios. Estos son órganos pequeños y en animales más viejos pueden ser incrustados en la grasa. Deslice la pinza bajo el ovario fin de aislarlo del cuerpo libre de la grasa y la trompa de Falopio.

En los machos, para quitar los testículos, sujete la almohadilla de grasa inguinal y tire suavemente hacia delante. Esto tirará el testículo del escroto. Una vez que llegan a ser visibles, cortar los accesorios para el escroto y el conducto deferente a estas estructuras del cuerpo.

a continuación, deje que ' s aprender a cosechar órganos torácicos, tales como el corazón y los pulmones. El corazón y los pulmones se quitan más fácilmente juntos. Para abrir la cavidad torácica, comience por colocar el animal en recumbency dorsal. En primer lugar, sujete y levante el proceso del xiphoid. Luego realizar un corte a través del músculo abdominal caudal justo en las costillas. Ampliar el corte a lo largo de la curva inferior de la caja torácica a ambos lados, exponiendo la membrana.

a continuación, perfore el diafragma haciendo un pequeño corte en la caja torácica punto a lo más lateral posible en cada lado. Luego, se corta el diafragma de las costillas. Ahora levantar las costillas en el xifoides para visualizar los órganos torácicos. Extender los laterales cortar la parte superior del esternón en ambos lados para abrir el cofre. Luego coloca la pinza perpendicular a la tráquea y sujete firmemente la tráquea. Ahora, usando las tijeras, realice un corte perpendicular a anterior el fórceps. Esto debería cortar la tráquea y el esófago. Sin aflojar el apretón en la tráquea, levante caudalmente y cortar cualquier accesorio de los pulmones a la superficie de la columna vertebral en la caja torácica. Continúe hasta que usted es capaz de levantar el corazón y los pulmones libres de la cavidad torácica.

Para eliminar sólo el corazón, el órgano de Levante y corte cuidadosamente a través del saco pericárdico. A continuación, sostenga la aorta con las pinzas y hacer un corte distal a las pinzas. Luego separa el anterior de la vena cava, arterias pulmonares y las venas. Después de eso, usted debe ser capaz de levantar el corazón libre de la cavidad torácica.

, pues ' s revisar el procedimiento de recolección el cerebro mediante una técnica aséptica. En casos donde el cerebro es el único órgano que se recogerá, el preparar pasos son los mismos.

Para iniciar la cosecha, saturar el cuerpo con alcohol y tira de la piel del cuerpo como antes, encima y sobre el cráneo. Esto permite que todo sea estéril desde este punto hacia adelante. Entonces, saturar el animal con el alcohol, retire los guantes exteriores y desechar los instrumentos utilizados en la piel. Ahora hacer un corte en la nuca del cuello y extenderlo a lo largo de la línea media de la zona cervical dorsal hasta la punta de la nariz.

Ahora, con una dedicada cerebro estéril tijeras de cosecha, hacer un corte a través de la columna vertebral en la base del cráneo. Para abrir el cráneo, coloque la punta de las tijeras en el foramen magnum y corte a lo largo de la línea media. Tenga en cuenta que durante este procedimiento de cerebro, una mano se considera no estéril como agarra la piel del cráneo refleja debajo de la barbilla a la cabeza, mientras la mano estéril se utiliza para cortar el cráneo. Después de eso, utilice el borde plano de la hoja de tijera de palanca de los huesos parietales del cerebro. Y con cuidado utilizando la espátula, interrumpir los accesorios del nervio en el tronco cerebral y el quiasma óptico, debajo del cerebro. Por último, deslice la pinza cerrada anterior y romper los accesorios en los bulbos olfativos. Y el cerebro puede entonces ser caído del cráneo directamente los medios estériles.

ahora que ' ve revisó los elementos esenciales de la cosecha de tejido estéril, que ' s discutir algunas de las muchas aplicaciones de este procedimiento en la investigación biomédica.

Vástago neuronales los investigadores utilizan una técnica recolección estéril para extraer tejido del cerebro neonatal ratón, crecer estas células en vitro. Esto les permite estudiar el papel de las células madre neurales en el desarrollo y progresión del cáncer de.

Otra área activa de investigación que implica la cosecha de tejido es perfilado metabólico, que implica estudiar la fisiología del tejido mediante el análisis de los diferentes metabolitos en una muestra. En este ejemplo, los científicos, usando una técnica aséptica, recogió las biopsias del hígado de tipo salvaje y ratones libres de gérmenes y utiliza la espectroscopia de resonancia magnética nuclear, o RMN, para aclarar la diferencia en el perfil metabólico hepático de las dos poblaciones de animales.

Por último, los inmunólogos a menudo realizan cosecha de tejido estéril para estudiar la propagación de la infección. En este experimento particular, investigadores realizaron inyección intratraqueal de la bacteria Pseudomonas aeruginosa para inducir la infección pulmonar crónica. A continuación, los animales fueron sacrificados y los pulmones fueron extraídos usando una técnica aséptica para determinar la carga bacteriana en 3, 7, 14 y 28 días post-infección.

te ' ve a Miró JoVE ' s video sobre recolección de tejidos procedentes de animales de laboratorio mediante una técnica aséptica. Ahora debería tener una mejor idea de los pasos que debe tomar para asegurarse de que la esterilidad se mantiene a través de la cosecha. Y debería poder extraer órganos abdominales y torácicos los cerebros de estos animales sin causar ningún daño al tejido. Como siempre, gracias por ver!

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