Overview
来源: 凯斯图尔特, RVT, RLATG, CMAR;瓦莱丽. 施罗德, RVT, RLATG。圣母大学, 在
在 1959年, W.M.S. 和 r.l 托里·伯奇在他们的著作《人类实验技术原理》中介绍了3的 R 和 #39. 3 R 和 #39; s 是在研究中使用动物的替换、减少和提炼。 1 使用源自研究动物的细胞系和组织培养是一种替代技术, 因为它允许许多实验在体外进行 . 在细胞和组织培养中使用的收集组织和器官需要无菌技术来避免组织的污染。无菌收获对组织的蛋白质和 RNA 分析以及代谢剖面也有必要。本论文将讨论大鼠和小鼠的无菌器官收获过程.
Principles
必须遵循无菌技术, 以确保组织不育。收获是在一个层流罩, 已被酒精消毒。所有使用的材料必须消毒。从事收割的技术员必须要有个人防护用品, 包括口罩、蓬松、无菌手术服和无菌手术手套。礼服必须覆盖手腕, 以防止脱落的皮肤细胞进入开放的体腔, 培养皿, 或无菌培养基。为了保持技术员的不育, 这个过程要求第二, 菌技术员协助无菌技术员与动物的安乐死。
在需要组织代谢剖面的实验中, 组织收获方法对收集的数据质量有很大的影响. 2 无论是安乐死的过程还是收获的时间长短都会影响组织的完整性。缺氧是一种具有二氧化碳的安乐死的结果, 它对组织中的代谢产物有深远的影响。肺组织中血管的出血也是由使用二氧化碳进行安乐死造成的。组织清除顺序解剖靶向组织, 可以导致新陈代谢的变化, 因为组织开始老化或腐烂期间的收获。
虽然大多数无菌收获的目标是单个器官, 但有时可能需要不止一个器官。在顺序解剖过程中, 所需的组织将决定它们应被移除的顺序。 2 快速降解的组织必须在安乐死之后尽快收割。为了保持器械的不育性, 从腹腔取出的器官按以下顺序除去: 脾脏、肝脏、肾脏、肾上腺、卵巢或睾丸、附属性器官 (前列腺、精囊泡、子宫、输卵管),胰腺组织, 淋巴结, 膀胱, 肠道 (胃, 小肠和大肠)。从胸腔取出器官的顺序是先除去心脏和肺部, 然后是胸腺、淋巴结和食道的集合。每个鼠标都需要 3 新手套.
一些不育的收获器官可能需要保存。组织的保存由闪光冷冻完成由液氮 (ln 在 2 ) 或以 ln 的组合 2 并且 2-丁烷。对于仅在 2 中, 组织在无菌盐水中冲洗, 涂抹在无菌吸水布上, 以耗尽多余的水分, 置于无菌的铝箔方块中, 并立即浸入 ln 2 。 2 对于免疫学标本, 增加 2-丁烷。该组织实际上被淹没到 2-丁烷, 已经冷却由 LN 2 。当组织变成白色时, 它们被从2丁烷中移除, 放置在无菌包中, 然后直接放入 LN 2 .
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Procedure
1. 准备
- 常用的材料包括: 在一个喷瓶中有70% 酒精、不育20-25 针、两包无菌的虹膜剪刀和拇指钳 (一个用于皮肤, 一个用于内部组织), 纸巾, 无菌外科手套, 无菌培养皿, 无菌培养基, 无菌生理盐水.
- 引擎盖风扇应在程序前至少运行15分钟, 并应使用70% 酒精进行消毒.
- 如果引擎盖装有紫外线杀菌灯, 则可用于进一步对工作表面进行消毒.
- 清洁手套是为遮光罩的设置而穿戴的。设备被装入引擎盖按他们将使用的顺序, 通常从左到右。这使得工作可以在单向工作流中进行, 防止脏项目污染干净的项目。这将保护所收获的组织或器官免受动物尸体的意外污染.
- 不育的仪器包打开, 尊重包装的无菌内部。为了保持不育, 包被放置在桌子的中心, 每个皮瓣是打开不越过无菌场或内部的包。菌的人打开第一个顶部皮瓣, 反映它远离他/她。侧襟翼然后打开使用两只手-一个在每个皮瓣-和拉他们远离包。最后的皮瓣, 然后拉向打开包的人, 小心避免触摸到包的内表面.
- 将纸巾放入引擎盖, 然后用酒精浸湿它们.
- 菌人将安乐动物.
- 不育者佩带两套无菌手术手套.
- 菌人把尸体放在纸巾上, 用70% 酒精完全浸泡在尸体上.
- 使用一组无菌剪刀和镊子, 在皮肤上进行横切口 (男性) 或骨盆骨 (雌性)。避免切割腹部肌肉.
- 将工具放在一旁.
2。收获组织
- 在女性的骨盆前和男性的包皮之上进行小切口.
- 将拇指置于切口下方, 并抓住切口的颅骨边缘。用另一只手, 安全地握住后肢和尾巴, 同时将皮肤拉向头部.
- 皮肤会从身体上方的后肢撕裂, 并能在头部和前腿内翻出来。这在器官收获期间有效地去除头发污染物.
- 再用70% 的酒精浸泡身体, 去掉表面上不再无菌的手套.
- 使用无菌器械打开腹腔。
- 脾脏
- 要获得脾脏, 身体定位在右外侧卧床.
- 脾脏可以通过腹部肌肉进行可视化.
- 剪刀切口直接在脾脏上进行.
- 脾脏被轻轻地从体腔中缩回.
- 当切断脾脏、胃和胰腺组织之间的所有附着物时, 避免穿刺或撕裂器官.
- 肝脏
- 要收获任何其他腹部器官, 身体置于背部卧床.
- 腹部肌肉被抬起并切掉, 在腹腔内留下一个椭圆形的开口.
- 暴露腹腔后, 反射肝脏尾远离隔膜.
- 小心切断将肝脏附着在隔膜上的任何膜.
- 通过肝脏和横膈膜之间可见的血管垂直于脊柱的切口.
- 抬起肝脏并将其反射到隔膜上, 以可视化其下方的附件.
- 将会有薄薄的膜附着较小的肝叶到胃和小肠, 这将需要被打乱.
- 抓住肝中央的纤维结节, 抬起器官找到所有的附件。将肝脏与基础器官和组织分开.
- 注意肝脏是脆弱的, 可以很容易刺破, 导致血液释放; 因此, 必须小心处理.
- 肾脏
- 在暴露腹腔后, 将肠道推到左侧, 以显示右肾, 或右侧的左肾可视化。
- 取出肾脏, 用镊子钳抓住肾脏下方的器官, 使其与身体隔绝。使用剪刀或手术刀刀片, 切断肾脏远离身体。在钳下做切口, 以避免损害肾脏.
- 一旦肾脏被切除, 任何脂肪都可以从器官中去除.
- 卵巢
- 暴露腹腔后, 移动肠道 cranially 以可视化子宫。
- 按照左侧, 然后向右, 子宫的角到卵巢.
- 卵巢小。在较年长的动物中, 它们可能嵌入脂肪.
- 滑动子房下的镊子将其从体内分离出来, 并将其从脂肪和输卵管中切开.
- 睾丸
- 打开腹腔后, 轻轻地抓住腹股沟脂肪垫并拉前。
- 这将从阴囊中取出睾丸.
- 一旦睾丸暴露, 切下阴囊和输精管的附着物, 将其从身体中释放出来.
- 这是为每个睾丸做的.
- 脾脏
- 胸腔打开以取出胸腔器官
- 身体放置在背卧床。如果要采集胸腔器官, 就必须将皮肤反射到头部以上.
- 抓住剑的过程和升降机, 让腹部肌肉切开, 只是尾鳍的肋骨。沿两侧肋骨保持架的下部曲线延伸切口。这将允许可视化的隔膜.
- 在每一侧可能的最侧面的肋骨上做一个小切口来刺穿横膈膜。把隔膜从肋骨上切下来.
- 在剑上抬起肋骨以可视化胸腔器官.
- 将侧切延伸至两侧胸骨的顶端, 然后打开胸腔.
- 心脏和肺部最容易被移除。
- 将镊子垂直于气管, 牢牢抓住气管.
- 使用剪刀, 将切口垂直于钳前的气管。这伤口应该切断气管和食道.
- 不松开气管的控制, 提起气管并尾。将肺部的任何附着物剪断肋骨笼中的脊柱表面.
- 食管可能需要切割, 以能够解除心脏和肺部无胸腔.
- 仅心脏
- 抬起心脏, 并仔细切开心包囊。
- 主动脉位于心脏的颅骨方面, 在动物和 #39左.
- 用钳夹住主动脉, 在钳远端做切口, 保持主动脉和心脏的固定.
- 当你切断前腔静脉和肺动脉和静脉时, 抓住主动脉.
- 用主动脉抬高胸腔的心脏.
- 其他胸腔器官
- 器官按下列顺序采集, 以维持器械的不育: 胸腺、淋巴结和食管。
- 大脑
- 在特殊情况下, 大脑将需要收获无菌的文化.
- 大脑在任何其他器官收获后都是最后收获的.
- 在大脑是唯一要收集的器官的情况下, 皮肤不会从身体中剥离出来, 而是在颈部的颈背上进行切割, 沿中线从背部颈部延伸到鼻尖.
- 在将皮肤从颅骨侧向外拉出后, 裸露的骨头被70% 酒精浸泡, 被弄脏的顶手套被移除.
- 使用一副专用的无菌脑收割剪刀, 在头骨底部切开脊柱.
- 打开头骨, 把剪刀的点放在枕孔上, 沿中线切开.
- 使用剪刀刀片的扁平端将顶骨骨从大脑中撬开.
- 小心地扰乱脑干的神经附着物, 用拇指钳的闭合点交叉大脑下方的视神经.
- 以类似的方式, 滑动关闭的钳前在大脑下方, 并打破了在嗅球的附件.
- 大脑可以从颅骨中掉入无菌介质.
- 当收割大脑时, 一只手会被认为是菌, 因为它能从头骨下方的颅骨中提取出的皮肤来稳定头部, 而头骨被切开, 大脑被移除.
- 皮肤
- 乳腺组织
- 乳房组织从胸骨顶部的柄到腹面上的生殖器开口处, 并侧向两侧伸展, 几乎在臀部和背部的背表面接触lders.
- 检查乳腺组织以查找肿块、变色或异常。哺乳或怀孕的女性将增加乳房组织容积, 牛奶可能存在.
- 乳腺切除术需要用拇指钳抓住腺体的边缘, 用钝夹层将皮肤的附着物松开。一旦腺体与皮肤分离, 虹膜剪刀可以用来切割任何剩余的附件.
- 用70% 的酒精浸泡暴露的表面, 并使用一套新的无菌器械开始收获组织.
- 在将收获的组织放入培养基中之前, 用无菌盐水冲洗.
- 乳腺组织
- 皮下肿瘤
- 通常, 肿瘤细胞被反复植入动物体内, 然后产生的肿瘤被捕获以维持肿瘤细胞系.
- 在皮肤和 #39 的完整性被破坏之前, 必须进行皮下肿瘤的无菌组织收获.
- 如果质量有磨损或坏死, 收集的组织质量不会很好, 并且可能不会被灭菌.
- 主体定位为暴露感兴趣的区域。皮肤沿着肿瘤的一侧切开.
- 仔细地反射皮肤以暴露肿瘤。将皮肤器械放在侧面, 用70% 酒精浸泡暴露的组织.
- 使用新的无菌仪器, 从底层的附着物中解剖肿块, 并切断任何给肿块喂食的血管.
- 肿瘤被放置在培养基中.
许多实验要求从切除的组织收集细胞。在这种情况下, 必须以不育的方式进行组织收获过程。利用来自研究动物的细胞系和组织培养物, 可以进行许多实验 体外 , whichin 反过来减少研究中的动物使用.
在本视频中, 我们将讨论从实验室动物中提取常用器官的无菌方法。接下来, 我们将对一些使用这种无菌技术的示例实验进行简短的回顾, 以实现不同的研究目标.
让与 #39; s 从准备步骤开始, 以确保在动物组织收获过程中的空间、仪器和人员不育.
此过程在层流罩中执行。在这个过程之前, 引擎盖风扇应该跑至少15分钟, 并且区域应该用70% 酒精消毒。接下来, 将一些纸巾放到引擎盖上, 用70% 乙醇将它们浸湿。然后, 加载无菌设备, 并按每种仪器的使用顺序进行组织, 通常从左到右。这使得工作流能够以单向的方式发生, 防止动物胴体的意外污染.
建议消毒技术人员到场协助无菌技术员。两个操作员必须佩带面具和蓬松。不育的技术员必须穿不育的礼服和两副无菌的外科手套。请注意, 礼服和手套必须覆盖手腕, 以防止脱落的皮肤细胞进入打开的体腔, 培养皿, 或无菌介质.
消毒人打开无菌仪器包, 不触及内表面, 使无菌的人可以删除工具菌。最后, 消毒技术员 euthanizes 动物, 放置在纸巾上的胴体和完全浸泡70% 酒精, 使无菌的人可以开始收割.
首先, 我们将检查腹部器官的提取, 包括脾脏、肝脏、肾脏、卵巢和睾丸.
使用一组无菌剪刀和镊子, 在男性的包皮和女性的骨盆骨前的皮肤上进行水平切割。避免切开腹部肌肉。接下来, 把拇指放在切口下面, 抓住切口的颅骨边缘。用另一只手, 安全地握住后肢和尾部, 同时将皮肤拉向头部。皮肤会从身体上的后肢上撕裂, 并可以在头部和前腿内翻出来。这有效地消除了可能干扰无菌器官收获的毛发污染物。然后, 再用70% 的酒精浸泡身体, 去掉表面的手套, 不再是无菌的。还要丢弃在皮肤上使用的所有仪器.
要收脾, 将身体置于右侧侧卧床。届脾应通过腹肌可见。用剪刀直接在脾脏上切开, 然后轻轻地从体腔中缩回器官。切断脾脏与胃和胰腺组织之间的所有附着物, 但避免穿刺或撕裂器官.
要收获所有其他腹部器官, 将身体置于背部卧床。然后, 抬起和切断腹部肌肉离开一个椭圆形开放直接在腹腔。为了收获肝脏, 反射器官尾远离隔膜。现在用剪刀小心地切断两个结构之间的任何隔膜。接下来, 通过血管垂直于脊柱的切口。然后抬起肝脏, 并将其反射到横膈膜上, 以可视化它下面的附件。将有薄薄的膜附着较小的肝叶到胃和小肠。抓住肝中央的纤维结节, 提起器官, 找到所有的附件。现在把器官与底层组织分开。请注意, 肝脏是脆弱的, 可以很容易地刺穿导致血液过量释放。因此, 必须小心处理.
要获取肾脏, 请将肠道推到左侧, 以暴露右肾或右侧暴露左肾。现在用钳子刀片抓住肾脏下面, 用钳子割下剪刀, 将器官从身体中移除.
cranially 卵巢, 移动肠道, 使子宫可视化。按照左和右子宫角的卵巢。这些是小的器官, 在较旧的动物中, 它们可能被嵌入脂肪中。在卵巢下滑动镊子, 将其从体内分离出来, 并从脂肪和输卵管中切下.
在男性中, 要除去睾丸, 轻轻抓住腹股沟脂肪垫并拉前。这将从阴囊中取出睾丸。一旦它们变得可见, 切下阴囊和输精管的附着物, 从身体中释放这些结构.
下一步, 让 & #39; s 学习如何收获胸器官, 如心脏和肺部。心脏和肺部最容易被移除。打开胸腔, 首先将动物置于背卧床。首先, 把握和提升剑过程。然后通过腹部肌肉切开肋骨。沿两侧肋骨的下部曲线延伸切口, 露出隔膜.
下一步, 通过在肋骨的每一侧可能的最侧面的一个小切口, 刺穿膜片。然后, 切断隔膜远离肋骨。现在抬起肋骨在剑, 以可视化的胸部器官。将侧切延伸至两侧胸骨顶端, 打开胸腔。然后将镊子垂直于气管, 牢牢抓住气管。现在, 用剪刀, 做一个垂直的切口只是前钳。这将切断气管和食道。在不松开气管的抓地力的情况下, 将其向上尾, 并将肺部的任何附着物剪断到肋骨笼中的脊柱表面。继续, 直到你能够解除心脏和肺部无胸腔.
取出心脏, 抬起器官, 仔细切开心包囊。接下来, 用镊子握住主动脉, 在镊子的远端做一个切口。然后切断前腔静脉、肺动脉和静脉。之后, 你应该能够解除心脏的胸腔.
现在, 让 & #39; s 检查使用无菌技术采集大脑的过程。在大脑是唯一要收集的器官的情况下, 准备步骤是相同的.
开始收割, 用酒精浸透身体, 并像以前一样从身体上剥下皮肤--向上和超过头骨。这使得所有的东西都从这一点上不育。然后, 再用酒精浸透动物, 取出外手套, 丢弃皮肤上使用的器械。现在, 在颈部的颈背上做一个切口, 并沿着背部颈部的中线延伸到鼻尖.
现在, 使用一双专用的无菌脑收获剪刀, 在头骨底部的脊柱上进行切割。要打开颅骨, 把剪刀的点放在枕孔上, 沿中线切开。请注意, 在这个脑部收获过程中, 一只手被认为是消毒的, 因为它能抓住下巴下方反射的颅骨来稳定头部, 而不育的手则被用来切割头骨。然后, 使用剪刀刀片的扁平边缘, 把顶骨的骨骼从大脑中撬开。使用刮刀, 小心地扰乱脑干的神经附着物和大脑下方的视神经交叉。最后, 滑动闭合钳前和打破在嗅球的附件。然后大脑就可以直接从头骨中掉落到无菌介质中.
现在我们和 #39; 我们回顾了无菌组织收获的要点, 让我们 #39 讨论了这一过程在生物医学研究中的许多用途.
神经干细胞研究人员使用无菌收获技术从小鼠新生儿脑中提取组织, 在体外培养这些细胞 。这使他们能够研究神经干细胞在发展和癌症进展中的作用.
另一个涉及组织收获的研究领域是新陈代谢剖面, 它包括通过分析样本中不同的代谢物来研究组织生理学。在这个例子中, 科学家使用无菌技术, 收集野生型和无菌小鼠的肝脏活检, 并使用核磁共振波谱, 以阐明两个动物群体的肝脏代谢特征的差异.
最后, 家经常进行无菌组织的收获, 以研究感染的传播。在这个特殊的实验中, 研究人员进行了气管内注射细菌 铜绿假单胞菌 , 以诱发慢性肺部感染。随后, 动物被安乐死, 用无菌技术提取肺部, 以确定3、7、14和28天感染的细菌负荷.
您和 #39; 我刚刚看了朱庇特和 #39; 从实验动物身上采集组织的视频, 用无菌技术。现在, 你应该更好地了解你需要采取的步骤, 以确保在整个收获过程中保持不育。你应该能够从这些动物身上提取腹部和胸部的器官和大脑, 而不会对组织造成任何损害。一如既往, 感谢收看!
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Applications and Summary
尽管许多无菌器官收获的程序与标准的尸检相似, 但使用无菌技术对于实验程序来说是必不可少的, 包括从切除的组织。如果不保持不育, 可以对组织中的 RNA 进行分析或收集.
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References
- Russel, W.M.S. and Burch, R.L. 1959. The Principles of Humane Experimental Technique. Methuen: London.
- Petucci, C., Rojas-Betancourt, S., and Gardell, S.J. 2012. Comparison of tissue harvest protocols for the quantitation of acylcarnitines in mouse heart and liver by mass spectrometry. Metabolomics. 8.784-792.
- Parkinson, C.M., O'Brien, A., Albers, T.M., Simon, M.A., Clifford, C.B., and Pritchett-Corning, K.R. 2011. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. 54. e2966. 1-7.
