Imágenes de fluorescencia infrarroja cercana de aneurismas aórticos abdominales

Biomedical Engineering

Your institution must subscribe to JoVE's Engineering collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Overview

Fuente: Arvin H. Soepriatna1, Kelsey A. Bullens2, y Craig J. Goergen1

1 Weldon School of Biomedical Engineering, Universidad Purdue, West Lafayette, Indiana

2 Departamento de Bioquímica, Universidad Purdue, West Lafayette, Indiana

La fluorescencia infrarroja cercana (NIRF) es una técnica óptica emocionante que utiliza sondas fluorescentes para visualizar conjuntos biomoleculares complejos en tejidos. Las imágenes NIRF tienen muchas ventajas sobre los métodos de diagnóstico por imágenes convencionales para la toma de imágenes no invasivas de enfermedades. A diferencia de la tomografía computarizada por emisión de fotones (SPECT) y la tomografía por emisión de positrones (PET), las imágenes NIRF son rápidas y de alto rendimiento y no implican radiación ionizante. Además, los recientes avances en la ingeniería de sondas fluorescentes específicas y activables proporcionan a NIRF una alta especificidad y sensibilidad, lo que la convierte en una modalidad atractiva en el estudio del cáncer y las enfermedades cardiovasculares. El procedimiento presentado está diseñado para demostrar los principios detrás de las imágenes NIRF y cómo llevar a cabo experimentos in vivo y ex vivo en animales pequeños para estudiar una variedad de enfermedades. El ejemplo específico que se muestra aquí emplea una sonda fluorescente activa para matriz metaloproteinasa-2 (MMP2) para estudiar su absorción en dos modelos diferentes de roedores de aneurismas de la aorta abdominal (AAA).

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Ingeniería Biomédica. Imágenes de fluorescencia infrarroja cercana de aneurismas aórticos abdominales. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Principles

Como su nombre indica, las imágenes NIRF utilizan luz dentro de la primera ventana de infrarrojo cercano, que va de 650 nm a 900 nm, para entregar fotones en el tejido. La energía, E, de un fotón se caracteriza por la Ecuación 1, donde h es la constante del Planck, c es la velocidad de la luz en un vacío, y es la longitud de onda de la luz.

Equation 1Equation 2 (Ecuación 1)

Las moléculas fluorescentes específicas de destino llamadas fluoróforos se introducen típicamente en el animal a través de la ingeniería genética o a través de la inyección de venas de cola antes de la toma de imágenes. Estos fluoróforos absorben la energía del fotón, que eleva la energía de las moléculas desde el estado del suelo, S0, al estado inestable y excitado S1'. Debido a la inestabilidad del estado S1', las moléculas se relajan al nivel de energía vibratoria más bajo dentro de ese estado y liberan energía en forma de calor. Los fluoróforos, ahora en el estado relajado y excitado S1, luego regresan al estado de tierra S0, emitiendo luz en una longitud de onda específica. La luz emitida, que tiene una longitud de onda más larga debido a la disipación de energía en forma de calor, se captura y se registra mediante un sistema de imágenes de fluorescencia. El cambio fundamental entre los espectros de absorción y emisión se llama el cambio Stokes y es importante, ya que permite diferenciar entre la excitación y la luz de emisión.

Procedure

El siguiente procedimiento proporciona los pasos detallados necesarios para recopilar imágenes in vivo y ex vivo DE NIRF de animales pequeños:

1. Configuración experimental

  1. Conecte una fuente de luz de fibra óptica al sistema de imágenes de fluorescencia mediante una guía de luz de fibra óptica.
  2. Seleccione el filtro de excitación adecuado para el experimento. El filtro de excitación determina la longitud de onda de la luz que se entregará a la muestra y debe elegirse para que coincida con el espectro de excitación del fluoróforo introducido en la muestra.
  3. Seleccione el filtro de emisión adecuado. El filtro de emisión bloquea los componentes espectrales no deseados, que pueden atribuirse a la autofluorescencia, y deben elegirse para que coincidan con el espectro de emisión del fluoróforo.

2. Preparación de muestras

  1. In Vivo
    1. Anestetizar al animal en una cámara de inducción utilizando isoflurano a una concentración de 3-4% en la esfera del caudalímetro.
    2. Transfiera el animal a un cono nasal que esté fijado en la etapa de toma de imágenes y mantenga el isoflurano en una concentración de 1-2%. Una fuente de calor no es necesaria porque los animales normalmente sólo se imaginan durante un corto período de tiempo (> 5 min), y su temperatura corporal no disminuye sustancialmente.
    3. Asegure las patas del animal para minimizar los artefactos de movimiento. Retire el vello de la región de interés aplicando una crema depilatoria.
    4. Aplicar crema depilatoria en la zona más pequeña necesaria. Después de 30 s, límpielo con una gasa. Limpie la zona por segunda vez con una gasa humedecida con alcohol etílico para eliminar por completo la crema depilatoria.
    5. Aplique pomada oftálmica en los ojos para evitar el secado de las córneas.
    6. Inyecte la sonda molecular fluorescente activa en el animal. Para esta aplicación específica, las sondas activables MMP2 se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola. En este punto, se puede crear una imagen del ratón. Proceda a la "Adquisición de imagen" de este protocolo para continuar. Supervise al animal para la respiración regular durante todo el breve procedimiento.
  2. Ex Vivo
    1. Después de la inyección de la sonda fluorescente, eutanasia al animal de una manera humana de acuerdo con las Directrices AVMA 2013 para la eutanasia de los animales. La sobredosis de dióxido de carbono (CO2)es una práctica estándar para la eutanasia de animales pequeños.
    2. Extraiga quirúrgicamente el tejido u órgano de interés y retire cuidadosamente el exceso de tejido adiposo con fórceps.
    3. Enjuague el tejido con solución salina tamponada de fosfato para eliminar la sangre residual y colocar la muestra directamente en la etapa de toma de imágenes.

3. Adquisición de imágenes

  1. Abra el software de imágenes moleculares y encienda tanto la fuente de luz de fibra óptica como el sistema de imágenes de fluorescencia.
  2. Abra la ventana de adquisición y especifique el tipo de exposición adecuado para el estudio. Las exposiciones disponibles incluyen: Exposición estándar para capturar una sola imagen, Exposición de lapso de tiempo para capturar una serie de imágenes en un intervalo de tiempo fijo y Exposición progresiva para capturar una secuencia continua de exposiciones en diferentes momentos de exposición.
  3. Seleccione UV-Transillumination como fuente de iluminación.
  4. Utilizando la imagen previsualizada como referencia, ajuste el enfoque de la lente, el campo de visión y la f-stop/aperture en la cámara del sistema de captura para optimizar la calidad de imagen muestreada. Ajuste el tiempo de exposición y la posición de la muestra.
  5. Cierre la ventana de vista previa y asegúrese de que todos los parámetros de la ventana de adquisición coincidan con la configuración de la cámara y el filtro.
  6. Haga clic en 'Exponer' para adquirir y guardar la imagen.
  7. El software de imágenes moleculares estándar normalmente proporciona una variedad de herramientas analíticas, de medición y de corrección de imágenes para cuantificar las señales de fluorescencia para el análisis de imágenes.
  8. Al final de la sesión de imágenes, retire la muestra/animal, apague el sistema y limpie la etapa de diagnóstico para minimizar los daños en el sistema.

La fluorescencia infrarroja cercana es una técnica óptica que utiliza sondas fluorescentes para visualizar complejos conjuntos biomoleculares en tejidos. Esta técnica de imagen no invasiva, que también se conoce como NIRF, es rápida y no requiere radiación ionizante.

En EL NIRF, las sondas fluorescentes se pueden conjugar con moléculas pequeñas para una mayor especificidad para estudiar la progresión del cáncer y las enfermedades cardiovasculares. Se excitan por la luz casi infrarroja que penetra profundamente en el tejido y se pueden utilizar para delinear el tejido sano del tejido enfermo que altera la concentración de estas moléculas diana.

Este video ilustrará los principios detrás de las imágenes de fluorescencia casi infrarroja, así como cómo realizar experimentos in vivo y ex vivo en animales pequeños para estudiar una variedad de enfermedades.

Como su nombre indica, las imágenes por fluorescencia casi infrarroja utilizan luz dentro de la primera ventana de infrarrojo cercano que oscila entre 650 nanómetros y 900 nanómetros para entregar fotones en el tejido. Las moléculas fluorescentes específicas de destino llamadas fluoróforos se introducen típicamente en un animal a través de la ingeniería genética o la inyección antes de la toma de imágenes.

Estos fluoróforos absorben la energía del fotón que eleva la energía de las moléculas desde el estado de tierra S0 hasta el estado excitado inestable S1 prime. Debido a que este estado es inestable, las moléculas se relajarán al nivel de energía vibratoria más bajo dentro del estado excitado liberando su energía en forma de calor. Los fluoróforos, ahora en el estado relajado excitado S1, luego regresan al estado de tierra, emitiendo luz de una longitud de onda específica.

Esta luz tiene una longitud de onda más larga que la luz introducida originalmente en el fluoróforo debido a la energía que se disipa en forma de calor a medida que la molécula se relaja al nivel de energía vibratoria más bajo. La luz emitida se captura y se registra mediante un sistema de imágenes de fluorescencia.

Un gráfico de los espectros de absorción y emisión para el fluoróforo muestra el rango de longitudes de onda que el fluoróforo puede absorber y emitir respectivamente. Este cambio fundamental, que es la diferencia en nanómetros entre la absorción máxima y las longitudes de onda de emisión máxima, se denomina desplazamiento De Stokes. Cada fluoróforo tiene un cambio Stokes distinto que permite distinguir la luz de emisión de la luz emocionante y hace que las técnicas de imagen como NIRF sean posibles.

Después de haber revisado los principios principales de la imagen de fluorescencia casi infrarroja, ahora vamos a caminar a través del procedimiento paso a paso para preparar e imaginar un animal.

En primer lugar, utilice una guía de luz de fibra óptica para conectar una fuente de luz de fibra óptica al sistema de imágenes de fluorescencia. Seleccione el filtro de excitación que coincida con el espectro de excitación de la fluorescencia que se introducirá en la muestra para asegurarse de que se entrega la longitud de onda correcta de la luz.

A continuación, seleccione el filtro de emisión adecuado para que coincida con el espectro de emisión del fluoróforo, que bloqueará los componentes espectrales no deseados que pueden atribuirse a la autofluorescencia.

Para comenzar a prepararse para la toma de imágenes in vivo, utilice isoflurano para anestesiar al animal en una cámara de derribo. Transfiera el animal a un cono nasal que esté fijado en la etapa de toma de imágenes. Asegure las patas del animal para minimizar los artefactos de movimiento. Aplicar una crema depilatoria para eliminar el cabello de la zona de interés. Luego, aplica un pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar que las córneas se sequen.

Después de esto, inyectar la sonda molecular fluorescente activa en el animal. Para comenzar la adquisición de imágenes, abra el software de imágenes moleculares. Encienda tanto la fuente de luz de fibra óptica como el sistema de imágenes de fluorescencia.

A continuación, abra la ventana de adquisición y especifique el tipo de exposición adecuado para el estudio. Las exposiciones disponibles incluyen la exposición estándar para capturar una sola imagen, la exposición de lapso de tiempo para capturar una serie de imágenes en un intervalo de tiempo fijo y la exposición progresiva para capturar una secuencia continua de exposiciones en diferentes momentos de exposición.

A continuación, seleccione UV Transillumination como fuente de iluminación. Utilizando la imagen de vista previa como referencia, ajuste el enfoque, el campo de visión y el F-stop en la cámara del sistema de captura para optimizar la calidad de imagen muestreada. Ajuste el tiempo de exposición y la posición de la muestra según sea necesario. Después de esto, cierre la ventana de vista previa. Asegúrese de que todos los parámetros de la ventana de adquisición coincidan con la configuración de la cámara y el filtro. Haga clic en "Exponer" para adquirir y guardar la imagen.

Para prepararse para la toma de imágenes ex vivo, eutanasia al animal de forma humana tras la inyección de la sonda fluorescente. Con fórceps, retire cuidadosamente cualquier exceso de grasa periaortica. A continuación, extraiga quirúrgicamente el tejido u órgano de interés. Enjuague el tejido con solución salina tamponada de fosfato para eliminar la sangre residual. A continuación, coloque la muestra directamente en la fase de toma de imágenes.

Imagen del tejido ex vivo siguiendo el mismo protocolo descrito para la toma de imágenes in vivo. Cuando haya terminado, quite la muestra del escenario. Apague el sistema y limpie la etapa de imágenes.

Ahora que hemos completado el protocolo para obtener imágenes de campo de infrarrojo cercano, revisemos los resultados de esos escaneos.

En estas imágenes representativas, una sonda fluorescente activase se inyecta sistémicamente a través de la vena de la cola para visualizar la Matrix Metalloproteinase o MMP2. Aquí vemos una imagen in vivo NIRF de un ratón deficiente de apolipoproteína-E que desarrolló un aneurisma de la aorta abdominal después de la infusión de angiotensina II. Mientras que la mayoría de las pequeñas manchas de señal alta son de autofluorescencia de la piel, la vasculatura se presenta visualmente como estructuras tubulares con señales fluorescentes altas.

La segunda imagen representativa compara imágenes NIRF de aneurismas de la aorta abdominal de dos modelos animales diferentes. Uno, un aneurisma aórtico aórtico suprarrenal en un ratón deficiente de apolipoproteína e de angiotensina II. Y dos, un aneurisma aórtico aórtico infrarrenal en una rata infundida con elastasa pancreática porcina.

En cada uno, vemos un aumento en la actividad MMP2 en la región aneurisma de la aorta abdominal. El exceso de sondas fluorescentes se filtran y se acumulan en los riñones, lo que explica las señales fluorescentes brillantes observadas allí.

Veamos ahora algunas otras aplicaciones de imágenes de campo de infrarrojo cercano. En primer lugar, las imágenes NIRF se pueden utilizar para estudiar enfermedades cardiovasculares en modelos murinos.

En este estudio, los ratones knockout se inyectan con dos sondas fluorescentes de infrarrojo cercano diferentes. Las aortas se cosechan 24 horas más tarde y se evalúan mediante imágenes NIRF. Los resultados muestran una respuesta significativa de NIRF, lo que indica la presencia de una calcificación extensa que coubica con la acumulación de macrófagos.

Las imágenes NIRF también se pueden utilizar para localizar y evaluar tumores in vivo. En este estudio, se crean tejidos que simulan fantasmas mamarios que contienen inclusiones de simulación de tumores fluorescentes. A continuación, se simulan las aplicaciones de las imágenes NIRF durante la cirugía de conservación de mamas.

Los resultados muestran que las inclusiones similares a tumores son detectables por NIRF hasta una profundidad de aproximadamente dos centímetros. Las inclusiones más profundas que esto son detectables después de que las incisiones se hacen en el tejido fantasma superpuesto. Después de eliminar las inclusiones, el cirujano evalúa las imágenes NIRF. Cualquier fluorescencia restante, que indica la presencia de tumores, indica extirpación incompleta y luego se extirpa.

Acabas de ver la introducción de JoVE a las imágenes casi infrarrojas. Ahora debe comprender los principios de excitación y emisión de fluoróforos, cómo preparar a un animal para imágenes IN vivo y ex vivo NIRF, y algunas aplicaciones biomédicas. ¡Gracias por mirar!

Results

En las figuras 1-2 se muestran imágenes representativas de NIRF in vivo y ex vivo tomadas de roedores con aneurismas de la aorta abdominal (AAA). Una sonda fluorescente activa fue inyectada sistémicamente a través de la vena de cola para visualizar la actividad de la matriz metaloproteinasa-2 (MMP2). MMP2 es una enzima elastolítica implicada en la degradación de la matriz extracelular que desempeña un papel importante en la iniciación y progresión de La AAA. Todas las imágenes se adquirieron utilizando un filtro de excitación de 625 nm, un filtro de emisión de 700 nm y un tiempo de exposición de 60 segundos.

Figure 1
Figura 1: Una imagen representativa in vivo NIRF de un ratón apopoprotein E-deficienciat que desarrolló un AAA después de la infusión de angiotensina-II. La mayoría de las pequeñas manchas que muestran una señal alta provienen de la autofluorescencia de la piel (flechas amarillas). La vasculatura se puede visualizar como estructuras tubulares con señales de alta fluorescencia (flecha roja). Barra de escala: 1 cm.

La Figura 2 muestra un aumento en la actividad de MMP2 en la región aneurisma de la aorta abdominal, como se ve por el aumento observado en la intensidad de la señal en relación con las regiones sanas de la aorta abdominal. Este resultado es consistente con los resultados en la literatura que muestran niveles elevados de MMP2 dentro de AAA. El exceso de sondas fluorescentes se filtró y acumuló en los riñones, lo que llevó a señales fluorescentes brillantes.

Figure 2
Figura 2: Imágenes NIRF de AAA de dos modelos animales diferentes: (A) un AAA suprarrenal en angiotensina II-infusado apolipoprotein-E ratón deficiente y (B) un AAA infrarrenal en rata infundida con porcina pancreática elastasa. Las flechas amarillas apuntan a los AAA. Barras de escala: 3 mm.

Applications and Summary

Las imágenes NIRF se basan en sondas fluorescentes para cuantificar y visualizar conjuntos biomoleculares en tejidos. La energía de fotones absorbida de la luz infrarroja cercana excita las moléculas fluorescentes a un estado de energía más alto, y la luz emitida con una longitud de onda característica más larga es capturada por un sistema de imágenes de fluorescencia. Aquí, la aplicación de imágenes NIRF para estudiar la actividad De MMP2 en aneurismas de la aorta abdominal se demostró in vivo y ex vivo. A diferencia de SPECT o PET, que se consideran los estándares de oro en el estudio de los procesos metabólicos en el cuerpo de forma no invasiva, la imagen NIRF es una técnica de imagen rápida y de alto rendimiento que no implica radiación ionizante. Una de las limitaciones de esta modalidad es su profundidad de penetración relativamente pequeña. Aunque esta limitación hace que las imágenes clínicas de los tejidos profundos sean un reto, las imágenes NIRF desempeñan un papel importante en el estudio de tumores y enfermedades cardiovasculares en animales pequeños.

Dada la sonda fluorescente adecuada, muchas estructuras moleculares se pueden visualizar utilizando los procedimientos de diagnóstico por imágenes NIRF presentados para estudiar tanto el inicio de la enfermedad como la progresión en modelos animales pequeños. Las aplicaciones específicas ex vivo e in vivo incluyen 1) evaluación de la actividad de MMP en vasculatura de roedores, 2) detección temprana de tumores en diferentes tipos de cáncer, y 3) evaluación de la farmacocinética de nanopartículas y biodistribución para aplicaciones terapéuticas. Además del aumento de la actividad de MMP2 dentro de aAA, se han utilizado otras sondas fluorescentes MMP para estudiar la progresión de la aterosclerosis y para caracterizar la composición de la matriz extracelular cardíaca después de un infarto de miocardio. Además, el verde fluoróforo indocyanina se ha utilizado para estudiar la perfusión de tejido en modelos murinos de isquemia de las extremidades posteriores. Para profundizar más en la aplicación de imágenes NIRF en la detección temprana del cáncer, se pueden utilizar colorantes NIRF dirigidos a tumores para evaluar los márgenes tumorales y ayudar en los procedimientos de resección. La integración de fluoróforos infrarrojos cercanos en nanopartículas desarrolladas para la administración de fármacos permite a los científicos desarrollar terapias más eficaces basadas en nanopartículas para una variedad de enfermedades. Por último, la capacidad de localizar espacialmente la señal fluorescente en animales enteros o tejido intacto es una clara ventaja sobre otros ensayos enzimáticos convencionales (zymografía de gel) y análisis de proteínas (western blot) que requieren que los animales sean sacrificados y los tejidos sean homogeneizados.

El siguiente procedimiento proporciona los pasos detallados necesarios para recopilar imágenes in vivo y ex vivo DE NIRF de animales pequeños:

1. Configuración experimental

  1. Conecte una fuente de luz de fibra óptica al sistema de imágenes de fluorescencia mediante una guía de luz de fibra óptica.
  2. Seleccione el filtro de excitación adecuado para el experimento. El filtro de excitación determina la longitud de onda de la luz que se entregará a la muestra y debe elegirse para que coincida con el espectro de excitación del fluoróforo introducido en la muestra.
  3. Seleccione el filtro de emisión adecuado. El filtro de emisión bloquea los componentes espectrales no deseados, que pueden atribuirse a la autofluorescencia, y deben elegirse para que coincidan con el espectro de emisión del fluoróforo.

2. Preparación de muestras

  1. In Vivo
    1. Anestetizar al animal en una cámara de inducción utilizando isoflurano a una concentración de 3-4% en la esfera del caudalímetro.
    2. Transfiera el animal a un cono nasal que esté fijado en la etapa de toma de imágenes y mantenga el isoflurano en una concentración de 1-2%. Una fuente de calor no es necesaria porque los animales normalmente sólo se imaginan durante un corto período de tiempo (> 5 min), y su temperatura corporal no disminuye sustancialmente.
    3. Asegure las patas del animal para minimizar los artefactos de movimiento. Retire el vello de la región de interés aplicando una crema depilatoria.
    4. Aplicar crema depilatoria en la zona más pequeña necesaria. Después de 30 s, límpielo con una gasa. Limpie la zona por segunda vez con una gasa humedecida con alcohol etílico para eliminar por completo la crema depilatoria.
    5. Aplique pomada oftálmica en los ojos para evitar el secado de las córneas.
    6. Inyecte la sonda molecular fluorescente activa en el animal. Para esta aplicación específica, las sondas activables MMP2 se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola. En este punto, se puede crear una imagen del ratón. Proceda a la "Adquisición de imagen" de este protocolo para continuar. Supervise al animal para la respiración regular durante todo el breve procedimiento.
  2. Ex Vivo
    1. Después de la inyección de la sonda fluorescente, eutanasia al animal de una manera humana de acuerdo con las Directrices AVMA 2013 para la eutanasia de los animales. La sobredosis de dióxido de carbono (CO2)es una práctica estándar para la eutanasia de animales pequeños.
    2. Extraiga quirúrgicamente el tejido u órgano de interés y retire cuidadosamente el exceso de tejido adiposo con fórceps.
    3. Enjuague el tejido con solución salina tamponada de fosfato para eliminar la sangre residual y colocar la muestra directamente en la etapa de toma de imágenes.

3. Adquisición de imágenes

  1. Abra el software de imágenes moleculares y encienda tanto la fuente de luz de fibra óptica como el sistema de imágenes de fluorescencia.
  2. Abra la ventana de adquisición y especifique el tipo de exposición adecuado para el estudio. Las exposiciones disponibles incluyen: Exposición estándar para capturar una sola imagen, Exposición de lapso de tiempo para capturar una serie de imágenes en un intervalo de tiempo fijo y Exposición progresiva para capturar una secuencia continua de exposiciones en diferentes momentos de exposición.
  3. Seleccione UV-Transillumination como fuente de iluminación.
  4. Utilizando la imagen previsualizada como referencia, ajuste el enfoque de la lente, el campo de visión y la f-stop/aperture en la cámara del sistema de captura para optimizar la calidad de imagen muestreada. Ajuste el tiempo de exposición y la posición de la muestra.
  5. Cierre la ventana de vista previa y asegúrese de que todos los parámetros de la ventana de adquisición coincidan con la configuración de la cámara y el filtro.
  6. Haga clic en 'Exponer' para adquirir y guardar la imagen.
  7. El software de imágenes moleculares estándar normalmente proporciona una variedad de herramientas analíticas, de medición y de corrección de imágenes para cuantificar las señales de fluorescencia para el análisis de imágenes.
  8. Al final de la sesión de imágenes, retire la muestra/animal, apague el sistema y limpie la etapa de diagnóstico para minimizar los daños en el sistema.

La fluorescencia infrarroja cercana es una técnica óptica que utiliza sondas fluorescentes para visualizar complejos conjuntos biomoleculares en tejidos. Esta técnica de imagen no invasiva, que también se conoce como NIRF, es rápida y no requiere radiación ionizante.

En EL NIRF, las sondas fluorescentes se pueden conjugar con moléculas pequeñas para una mayor especificidad para estudiar la progresión del cáncer y las enfermedades cardiovasculares. Se excitan por la luz casi infrarroja que penetra profundamente en el tejido y se pueden utilizar para delinear el tejido sano del tejido enfermo que altera la concentración de estas moléculas diana.

Este video ilustrará los principios detrás de las imágenes de fluorescencia casi infrarroja, así como cómo realizar experimentos in vivo y ex vivo en animales pequeños para estudiar una variedad de enfermedades.

Como su nombre indica, las imágenes por fluorescencia casi infrarroja utilizan luz dentro de la primera ventana de infrarrojo cercano que oscila entre 650 nanómetros y 900 nanómetros para entregar fotones en el tejido. Las moléculas fluorescentes específicas de destino llamadas fluoróforos se introducen típicamente en un animal a través de la ingeniería genética o la inyección antes de la toma de imágenes.

Estos fluoróforos absorben la energía del fotón que eleva la energía de las moléculas desde el estado de tierra S0 hasta el estado excitado inestable S1 prime. Debido a que este estado es inestable, las moléculas se relajarán al nivel de energía vibratoria más bajo dentro del estado excitado liberando su energía en forma de calor. Los fluoróforos, ahora en el estado relajado excitado S1, luego regresan al estado de tierra, emitiendo luz de una longitud de onda específica.

Esta luz tiene una longitud de onda más larga que la luz introducida originalmente en el fluoróforo debido a la energía que se disipa en forma de calor a medida que la molécula se relaja al nivel de energía vibratoria más bajo. La luz emitida se captura y se registra mediante un sistema de imágenes de fluorescencia.

Un gráfico de los espectros de absorción y emisión para el fluoróforo muestra el rango de longitudes de onda que el fluoróforo puede absorber y emitir respectivamente. Este cambio fundamental, que es la diferencia en nanómetros entre la absorción máxima y las longitudes de onda de emisión máxima, se denomina desplazamiento De Stokes. Cada fluoróforo tiene un cambio Stokes distinto que permite distinguir la luz de emisión de la luz emocionante y hace que las técnicas de imagen como NIRF sean posibles.

Después de haber revisado los principios principales de la imagen de fluorescencia casi infrarroja, ahora vamos a caminar a través del procedimiento paso a paso para preparar e imaginar un animal.

En primer lugar, utilice una guía de luz de fibra óptica para conectar una fuente de luz de fibra óptica al sistema de imágenes de fluorescencia. Seleccione el filtro de excitación que coincida con el espectro de excitación de la fluorescencia que se introducirá en la muestra para asegurarse de que se entrega la longitud de onda correcta de la luz.

A continuación, seleccione el filtro de emisión adecuado para que coincida con el espectro de emisión del fluoróforo, que bloqueará los componentes espectrales no deseados que pueden atribuirse a la autofluorescencia.

Para comenzar a prepararse para la toma de imágenes in vivo, utilice isoflurano para anestesiar al animal en una cámara de derribo. Transfiera el animal a un cono nasal que esté fijado en la etapa de toma de imágenes. Asegure las patas del animal para minimizar los artefactos de movimiento. Aplicar una crema depilatoria para eliminar el cabello de la zona de interés. Luego, aplica un pomada oftálmica en los ojos del animal para evitar que las córneas se sequen.

Después de esto, inyectar la sonda molecular fluorescente activa en el animal. Para comenzar la adquisición de imágenes, abra el software de imágenes moleculares. Encienda tanto la fuente de luz de fibra óptica como el sistema de imágenes de fluorescencia.

A continuación, abra la ventana de adquisición y especifique el tipo de exposición adecuado para el estudio. Las exposiciones disponibles incluyen la exposición estándar para capturar una sola imagen, la exposición de lapso de tiempo para capturar una serie de imágenes en un intervalo de tiempo fijo y la exposición progresiva para capturar una secuencia continua de exposiciones en diferentes momentos de exposición.

A continuación, seleccione UV Transillumination como fuente de iluminación. Utilizando la imagen de vista previa como referencia, ajuste el enfoque, el campo de visión y el F-stop en la cámara del sistema de captura para optimizar la calidad de imagen muestreada. Ajuste el tiempo de exposición y la posición de la muestra según sea necesario. Después de esto, cierre la ventana de vista previa. Asegúrese de que todos los parámetros de la ventana de adquisición coincidan con la configuración de la cámara y el filtro. Haga clic en "Exponer" para adquirir y guardar la imagen.

Para prepararse para la toma de imágenes ex vivo, eutanasia al animal de forma humana tras la inyección de la sonda fluorescente. Con fórceps, retire cuidadosamente cualquier exceso de grasa periaortica. A continuación, extraiga quirúrgicamente el tejido u órgano de interés. Enjuague el tejido con solución salina tamponada de fosfato para eliminar la sangre residual. A continuación, coloque la muestra directamente en la fase de toma de imágenes.

Imagen del tejido ex vivo siguiendo el mismo protocolo descrito para la toma de imágenes in vivo. Cuando haya terminado, quite la muestra del escenario. Apague el sistema y limpie la etapa de imágenes.

Ahora que hemos completado el protocolo para obtener imágenes de campo de infrarrojo cercano, revisemos los resultados de esos escaneos.

En estas imágenes representativas, una sonda fluorescente activase se inyecta sistémicamente a través de la vena de la cola para visualizar la Matrix Metalloproteinase o MMP2. Aquí vemos una imagen in vivo NIRF de un ratón deficiente de apolipoproteína-E que desarrolló un aneurisma de la aorta abdominal después de la infusión de angiotensina II. Mientras que la mayoría de las pequeñas manchas de señal alta son de autofluorescencia de la piel, la vasculatura se presenta visualmente como estructuras tubulares con señales fluorescentes altas.

La segunda imagen representativa compara imágenes NIRF de aneurismas de la aorta abdominal de dos modelos animales diferentes. Uno, un aneurisma aórtico aórtico suprarrenal en un ratón deficiente de apolipoproteína e de angiotensina II. Y dos, un aneurisma aórtico aórtico infrarrenal en una rata infundida con elastasa pancreática porcina.

En cada uno, vemos un aumento en la actividad MMP2 en la región aneurisma de la aorta abdominal. El exceso de sondas fluorescentes se filtran y se acumulan en los riñones, lo que explica las señales fluorescentes brillantes observadas allí.

Veamos ahora algunas otras aplicaciones de imágenes de campo de infrarrojo cercano. En primer lugar, las imágenes NIRF se pueden utilizar para estudiar enfermedades cardiovasculares en modelos murinos.

En este estudio, los ratones knockout se inyectan con dos sondas fluorescentes de infrarrojo cercano diferentes. Las aortas se cosechan 24 horas más tarde y se evalúan mediante imágenes NIRF. Los resultados muestran una respuesta significativa de NIRF, lo que indica la presencia de una calcificación extensa que coubica con la acumulación de macrófagos.

Las imágenes NIRF también se pueden utilizar para localizar y evaluar tumores in vivo. En este estudio, se crean tejidos que simulan fantasmas mamarios que contienen inclusiones de simulación de tumores fluorescentes. A continuación, se simulan las aplicaciones de las imágenes NIRF durante la cirugía de conservación de mamas.

Los resultados muestran que las inclusiones similares a tumores son detectables por NIRF hasta una profundidad de aproximadamente dos centímetros. Las inclusiones más profundas que esto son detectables después de que las incisiones se hacen en el tejido fantasma superpuesto. Después de eliminar las inclusiones, el cirujano evalúa las imágenes NIRF. Cualquier fluorescencia restante, que indica la presencia de tumores, indica extirpación incompleta y luego se extirpa.

Acabas de ver la introducción de JoVE a las imágenes casi infrarrojas. Ahora debe comprender los principios de excitación y emisión de fluoróforos, cómo preparar a un animal para imágenes IN vivo y ex vivo NIRF, y algunas aplicaciones biomédicas. ¡Gracias por mirar!

JoVE Science Education is free through June 15th 2020.

RECOMMEND JoVE