Visualisierung der Kniegelenkdegeneration nach nichtinvasiver ACL-Verletzung bei Ratten

Biomedical Engineering

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Overview

Quelle: Lindsey K. Lepley1,2, Steven M. Davi1, Timothy A. Butterfield3,4 und Sina Shahbazmohamadi5,

1 Institut für Kinesiologie, University of Connecticut, Storrs, CT; 2 Department of Orthopaedic Surgery, University of Connecticut Health Center, Farmington, CT; 3 Department of Rehabilitation Sciences, University of Kentucky, Lexington, KY; 4 Center for Muscle Biology, Department of Physiology, University of Kentucky, Lexington, KY; 5 Biomedical Engineering Department, University of Connecticut, Storrs, CT

Die Verletzung des vorderen Kreuzbandes (ACL) am Knie erhöht das Risiko einer posttraumatischen Arthrose (PTOA) drastisch, da etwa ein Drittel der Personen innerhalb des ersten Jahrzehnts nach einer ACL-Verletzung eine radiologische PTOA nachweisen wird. Obwohl die ACL-Rekonstruktion (ACLR) erfolgreich die Kniegelenkstabilität wiederherstellt, verhindern ACLR und aktuelle Rehabilitationstechniken nicht den Beginn von PTOA. Daher ist aCL-Verletzung das ideale Modell, um die Entwicklung von PTOA nach traumatischen Gelenkverletzungen zu untersuchen.

Rattenmodelle wurden ausgiebig verwendet, um den Beginn und die Wirkung von ACL-Verletzungen auf PTOA zu untersuchen. Das am weitesten verbreitete Modell der ACL-Verletzung ist aCL-Transektion, ein akutes Modell, das das Gelenk operativ destabilisiert. Obwohl praktisch, imitiert dieses Modell menschliche ACL-Verletzungen aufgrund der invasiven und nicht-physiologischen Verletzungsverfahren, die die einheimische biologische Reaktion auf Verletzungen maskieren, nicht originalgetreu. Um die klinische Übersetzung unserer Ergebnisse zu verbessern, haben wir vor kurzem ein neuartiges nicht-invasives Modell für ACL-Verletzungen entwickelt, bei dem die ACL durch eine einzige Last tibiaialer Kompression gebrochen wird. Diese Verletzung repliziert die für den Menschen relevanten Verletzungsbedingungen und ist sehr reproduzierbar.

Die Visualisierung der Gelenkdegeneration durch Mikro-Computertomographie (CT) bietet mehrere wichtige Fortschritte gegenüber herkömmlichen OA-Färbetechniken, einschließlich schneller, hochauflösender, zerstörungsfreier 3D-Bildgebung ganzer Gelenkdegeneration. Ziel dieser Demonstration ist es, den Stand der Technik nicht-invasive ACL-Verletzungen in ein Nagetiermodell einzuführen und die Degeneration der Kniegelenke mit dem Einsatz von "CT" zu quantifizieren.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Biomedizinische Technik. Visualisierung der Kniegelenkdegeneration nach nichtinvasiver ACL-Verletzung bei Ratten. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Principles

Die ACL ist eine bandartige Struktur aus dichtem Bindegewebe, die aus dem vorderen interkongdylaren Raum der Tibia entsteht und sich überlegen und seitlich auf den hinteren Aspekt des seitlichen Kondyle des Oberschenkelknochens erstreckt. Strukturell dient der ACL sowohl als passiver Stabilisator des Knies, das in Abstimmung mit anderen Bändern arbeitet, sowie als Oberschenkelmuskulatur, um das Gelenk während der dynamischen Bewegung zu kontrollieren. Die ACL ist die primäre Zurückhaltung gegenüber der vorderen tibialen Verschiebung und spielt eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Kniegelenkstabilität. Neben der strukturellen Unterstützung fungiert die ACL auch als Weg für neuronale Informationen zwischen Kniegelenk und zentralem Nervensystem. Die größte Belastung für die ACL tritt auf, wenn das Knie in der Nähe der Verlängerung ist, und es ist während dieser Zeit, dass die ACL ist mit dem höchsten Verletzungsrisiko.

Der ACL ist das am häufigsten verletzte Knieband während des Sports und der arbeitsbedingten Aktivitäten. Berührungslose ACL-Verletzungen machen fast 70 % aller ACL-Verletzungen aus, und sie treten auf, wenn eine Person genügend Kräfte und/oder Momente am Knie erzeugt, was zu einer übermäßigen Belastung der ACL führt. Obwohl der Mechanismus der berührungslosen ACL-Verletzung mit einer Vielzahl von Forschungsmodellen (prospektiv, retrospektiv, beobachtungs-, in vivo und in vitro)untersucht wurde, bleibt eine direkte Bestimmung darüber, wie eine Verletzung auftritt, schwer fassbar. Die ACL-Rekonstruktion wird oft durch chirurgisches Einsetzen eines Teils der Personen hamstring oder Patellarsehnen in den Bereich der ACL durchgeführt. Das Ziel der chirurgischen Rekonstruktion ist es, die Kniestabilität und Funktionsfähigkeit zu maximieren, die nach der Verletzung verloren gegangen sind. Die chirurgische Rekonstruktion erleichtert eine sichere Rückkehr zum Sport und fördert die langfristige Gesundheit der Kniegelenke. Trotz der besten Bemühungen von Ärzten und Forschern kehren jedoch fast zwei Drittel der Patienten mit rekonstruierten ACLs rekonstruierten Patienten nach 12 Monaten nach der Rekonstruktion nicht wieder in die Aktivität zurück und mehr als 50% der aCL rekonstruierten Knie haben radiologische Anzeichen von PTOA 5-14 Jahre nach der Verletzung.

Tiermodelle bieten sowohl eine praktische als auch eine klinisch relevante Möglichkeit, die Naturgeschichte und die Reaktion der Behandlung auf die Gesundheit der Gelenke zu untersuchen. Wichtig ist, dass das Knie einer Ratte eine ähnliche Anatomie und Funktion wie Knie beim Menschen hat, was das Rattenknie zu einem nützlichen Modell macht, um PTOA nach ACL-Verletzungen zu studieren. Um die klinische Übersetzung unserer Ergebnisse zu verbessern, haben wir vor kurzem ein neuartiges nicht-invasives Modell der ACL-Verletzung entwickelt, bei dem die ACL durch eine einzige Last der tibiaellen Kompression gebrochen wird. Diese Verletzung repliziert die für den Menschen relevanten Verletzungsbedingungen und ist sehr reproduzierbar.

Das Ladegerät besteht aus zwei kundenspezifischen Ladeplattformen (Abbildung 1); die obere Kniestufe ist starr an einem Linearantrieb (DC Linearaktuator L16-63-12-P, Phidgets, Alberta, CA) montiert, der das rechte Hinterglied in 30°1-3 dorsiflexion und 100°1 der Kniebeugung positioniert und gleichzeitig Raum für eine vordere Subluxation der Tibia relativ zum Oberschenkelknochen bietet; die untere Stufe hält das gebeugte Knie und ist direkt über einer Wägezelle montiert (HDM Inc., PW6D, Southfield, MI). Während der Verletzung werden Ratten beästheisiert und dann wird das rechte Hinterglied einer einzellastigen Tibiakompression mit einer Geschwindigkeit von 8 mm/s ausgesetzt.1 ACL-Verletzung wird durch eine Freisetzung von Druckkraft während der Verletzung festgestellt, die über ein benutzerdefiniertes Programm überwacht wird (LabVIEW, National Instruments, Austin, TX). Nach der Verletzung wird der ACL-Bruch klinisch durch den Lachman-Test bestätigt, bei dem der Oberschenkelknochen gesichert ist, während eine vordere Kraft auf die Tibia angewendet wird. Übermäßige vordere tibiale Übersetzung weist auf einen ACL-Mangel hin. Das ACL verletzte Hinterglied kann dann in einem kundenspezifischen 3D-gedruckten Gerät erweitert und gesichert werden, um die Kniegelenkdegeneration zu visualisieren. Bilder werden erfasst, um Veränderungen in der trabekulären Struktur im Zusammenhang mit der PTOA-Entwicklung zu charakterisieren. 4

Figure 1
Abbildung 1: Tibiale Druckbelastung, die eine isolierte nicht-invasive ACL-Verletzung verursacht.

Procedure

Nicht-invasive ACL-Verletzung

  1. Tragen Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung. Sie können eine Atemmaske verwenden, aber es ist nicht obligatorisch für dieses Protokoll.
  2. Anästhesisieren Sie die Ratten mit einer Induktionskammer mit 5% Isofluran und 1 L/min Sauerstoff. Halten Sie den Fluss der Anästhesie mit über einen Nasenkegel mit 1 - 3% Isofluran und 500 ml/min Sauerstoff aufrecht. Wenn das Gerät nicht auf einem Rück- oder Tiefzugtisch aufgestellt ist, stellen Sie sicher, dass Das Abgas mit einem Tischsystem und Holzkohlefiltern aufgeräumt wird.
  3. Führen Sie eine Zehenklemme durch, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Tiefe des Anästhetikums erreicht wurde. Beachten Sie, dass es nicht notwendig ist, Augenschmiermittel aufzutragen, das Protokoll wird schnell durchgeführt (< 3 min) und es besteht ein minimales Risiko der Hornhauttrockenheit.
  4. Positionieren Sie das rechte Hinterglied bei 30° Dorsiflexion und 100° Kniebeugung und bieten Sie gleichzeitig Raum für eine vordere Subluxation der Tibia im Vergleich zum Oberschenkelknochen.
  5. Montieren Sie die obere Kniestufe starr an einem Linearantrieb.
  6. Positionieren Sie das gebeugte Knie auf der unteren Stufe, die direkt über einer Wägezelle montiert ist.
  7. Induzieren Sie ACL-Verletzungen mit einer einzigen Last von tibialer Kompression mit einer Geschwindigkeit von 8 mm/s.
  8. ACL-Verletzungen werden durch eine Freisetzung von Druckkraft festgestellt. Dies wird über ein benutzerdefiniertes Programm überwacht.
  9. Nach der Verletzung, während das Tier noch unter der Ebene der Anästhesie ist, führen Sie einen Lachman-Test durch, um klinisch zu bestätigen, dass ein ACL-Ruptur aufgetreten ist. Ein Lachman-Test ist ein klinischer Test, der verwendet wird, um die Integrität der ACL zu bewerten, indem die Stabilität des sagittalen Plans bewertet wird. Während der Stabilisierung des Oberschenkelknochens ziehen Sie die Tibia nach vorne (in vorderer Richtung), um die Menge der Bewegung zu beurteilen. Eine intakte ACL erzeugt ein "festes Endgefühl", bei dem der Forscher nicht in der Lage sein wird, die Tibia vorwärts zu übersetzen. Eine verletzte ACL erzeugt ein "weiches oder matschiges Endgefühl", was auf eine zerrissene ACL hindeutet.
  10. Palpate den Oberschenkelknochen und Tibia, um alle groben Knochenschäden zu erkennen. Wenn keine Kontraindikationen festgestellt werden, überführen Sie das Tier in seinen Käfig und lassen Sie es sich erholen. Während dieser Zeit, überwachen Sie das Tier, um sicherzustellen, dass es keine Anzeichen von Schmerzen zeigt, wie z. B. eine Abneigung gegen Bewegung, Stimmbildung oder abnorme Haltung.

CT-Bildgebung der Gelenkdegeneration

2D-Bilder werden mit Scannereinstellungen von 70 kV, Strom 85,5 A(Abbildung 2B) erhalten. Die Daten werden jeden 0,6°-Drehschritt mit einer Auflösung von 11,5 m bis zu einer Gesamtauflösung von 180° erhoben. Querschnittsbilder werden mit einem geglätteten Rückprojektionsalgorithmus und auf dem Stapel rekonstruierter Bilder rekonstruiert (Abbildung 2C). Die Trabekuläre Struktur wird dann durch Segmentierung in Software analysiert, wobei eine 1,53 mm Kugel in der epiphysealen Platte der medialen und seitlichen Tibialplateaus und des Oberschenkelknochens zentriert ist, um die trabekuläre Dicke (m), die Trabeekulartrennung (m) und die Trabekularzahl (1/mm) zu bestimmen. 5,6

  1. Nach 4 Wochen nach der ACL-Verletzung die Ratte mit längerer CO2-Exposition in der Induktionskammer einschläfern.
  2. Erweitern und sichern Sie ACL verletzte hinterlimb in einem benutzerdefinierten 3D-gedruckten Gerät (Abbildung 2A).
  3. Erfassen Sie Bilder mit dem Wert von 'CT.
  4. Besorgen Sie sich frontale Ebenenröntgenaufnahmen, um den gemeinsamen Raum zu bestimmen. Verengung (zwischen dem femoralen Kondyle und dem Tibiaplateau [gemessen in mm]) im Vergleich zur nicht verletzten Gliedmaße.
  5. Erhalten Sie 2D-Bilder mit den folgenden Scannereinstellungen: 70 kV und Strom 85,5 A.
  6. Sammeln Sie die Daten jeden 0,6°-Drehschritt bei einer Pixelgröße von 11,5 m bis hin zu einem kompletten 180°.
  7. Rekonstruieren Sie Querschnittsbilder mit einem geglätteten Rückprojektionsalgorithmus auf dem Stapel rekonstruierter Bilder.
  8. Um einen konsistenten Interessenbereich zu messen, legen Sie eine 1,53 mm Kugel in die epiphyseale Platte der medialen und seitlichen Tibialplateaus und des Oberschenkelknochens, um die trabekuläre Dicke (m), die Trabekulartrennung (m) und die Trabekkulärzahl (1/mm) zu bestimmen.

Figure 2
Abbildung 2: A) Benutzerdefiniertes gedrucktes Gerät zur Ablage während der 2D-Bilder von CT, B und C) 3-D-CT.

Eine der häufigsten Knieverletzungen ist der Bruch oder Riss des vorderen Kreuzbandes, auch ACL genannt, mit fast einem Drittel der ACL-Verletzungen, die innerhalb eines Jahrzehnts zu posttraumatischen Arthrose oder PTOA führen.

Rattenmodelle wurden ausgiebig verwendet, um die Wirkung von ACL-Verletzungen auf PTOA zu untersuchen, da das Kniegelenk der Ratte ein enges Modell zum menschlichen Kniegelenk ist. Das am weitesten verbreitete Modell der ACL-Verletzung ist aCL-Transektion, bei der das Gelenk operativ destabilisiert wird. Dieses Modell repliziert jedoch nicht genau aCL-Verletzungsbedingungen beim Menschen.

In diesem Video werden wir ein neuartiges, nicht-invasives ACL-Verletzungsmodell für Ratten besprechen, die Verletzung und Bildgebung von verletzten Gelenken demonstrieren und schließlich die Forschung im Bereich der biomedizinischen Technik zur Bandreparatur überprüfen.

Das Knie besteht aus drei Knochen, dem Oberschenkelknochen, der Patella und der Tibia. Das vordere Kreuzband(ACL) ist eine bandartige Struktur aus dichtem Bindegewebe, die aus dem vorderen interkondylaren Raum der Tibia aufsteigt und sich überlegen und seitlich auf den hinteren Aspekt des seitlichen Kondyskose des Oberschenkelknochens erstreckt.

Die anderen Bänder im Knie sind das hintere Kreuzband, das laterale Kollateralband und das mediale Kollateralband. Strukturell dienen alle Bänder, insbesondere die ACL, als passive Stabilisatoren des Knies zusammen mit der Oberschenkelmuskulatur, um das Gelenk während der dynamischen Bewegung zu kontrollieren.

Die größte Belastung für die ACL tritt auf, wenn das Knie in der Nähe der Verlängerung ist, und es ist während dieser Zeit, dass die ACL ist mit dem höchsten Verletzungsrisiko. Tiermodelle bieten sowohl eine praktische als auch eine klinisch relevante Möglichkeit, Gelenkverletzungen und Behandlungen zu untersuchen. Insbesondere das Rattenkniemodell wird häufig zur Untersuchung von Knieverletzungen verwendet, da das Rattenknie dem menschlichen Knie sehr ähnlich ist. Um eine klinisch relevante ACL-Verletzung beim Menschen zu modellieren, wird eine einzige Last der tibiaellen Kompression angewendet. Wenn dies richtig durchgeführt wird, führt dies zu einem vollständigen Bruch der ACL.

ACL-verletzte Hinterglieder können dann mit Mikro-Computertomographie oder Micro CT abgebildet werden, um Gelenkverletzungen und Degeneration zu visualisieren. Micro CT ist eine bildgebende Technik, die Röntgenstrahlen verwendet, um Bilder eines Objekts zu erstellen, wie ein Gelenk. Diese Querschnitte werden über das Objekt hinweg gemessen und zu einer dreidimensionalen Rekonstruktion kombiniert. Weitere Informationen zu micro CT finden Sie im Video dieser Sammlung.

Nun, da wir das neuartige, nicht-invasive ACL-Verletzungsmodell der Ratte diskutiert haben, werfen wir einen Blick darauf, wie die Verletzung durchgeführt wird, gefolgt von einer Mikro-CT-Visualisierung des Gelenks.

Die ACL-Verletzung wird mit einem benutzerdefinierten Gerät durchgeführt, das eine einzelne Last der Kompression auf die Tibia einer anästhesierten Ratte induziert. Legen Sie zunächst eine Ratte in eine Induktionskammer mit fünf Prozent Isofluran und einem Liter sauerstoffreiche Minund. Nach der Beägung bewegen Sie die Ratte mit einem Nasenkegel auf das Gerät, um einen Fluss von ein bis drei Prozent Isofluran aufrechtzuerhalten. Positionieren Sie die rechte Hintergliedmaße bei 30 Grad Dorsaflexion und 100 Grad Kniebeugung.

Bewegen Sie die obere Kniestufe, die an einem Linearantrieb befestigt ist, mit einem Millimeter pro Sekunde. Achten Sie darauf, Platz für die vordere Subluxation der Tibia, relativ zum Oberschenkelknochen, zu schaffen. Positionieren Sie dann das gebeugte Knie auf der unteren Stufe, das über eine Wägezelle gerichtet montiert ist. Sobald die Ratte richtig positioniert ist, schalten Sie das benutzerdefinierte Gerät ein, öffnen Sie die Lab-Ansicht, und geben Sie eine Komprimierungsgeschwindigkeit von acht Millimetern pro Sekunde ein. Führen Sie dann den Test aus, um einen ACL-Ruptur mit einer einzigen Last der tibialen Kompression auszulösen. Überwachen Sie beim Ausführen des Tests die Prozedur. Die ACL-Verletzung wird durch die Freisetzung von Druckkraft festgestellt.

Nach der Verletzung, entfernen Sie die Ratte aus dem Gerät und legen Sie sie auf eine flache Oberfläche. Führen Sie dann Lachmans Test durch, um die Integrität der ACL zu bewerten. Während der Stabilisierung des Oberschenkelknochens, ziehen Sie die Tibia nach vorne. Eine intakte ACL erzeugt einen festen Endpunkt, während eine verletzte ACL ein weiches Endgefühl erzeugt. Sobald Lachmans Test durchgeführt wurde, kehren Sie die Ratte in ihr Gehäuse zurück, damit sie aus der Anästhesie aufwachen kann.

Lassen Sie uns nun das beschädigte Gelenk abbilden. Um sich auf mikroct-Bildgebung vorzubereiten, euthanisieren Sie die Ratte auf humane Weise gemäß AVMA-Richtlinien. Dann verlängern und sichern Sie die ACL-verletzten Hinterbeine mit mehreren Kunststoff-Reißverschluss-Krawatten, und sorgfältig manövrieren sie in das benutzerdefinierte Gerät. Die Hintergliedmaße sollte innerhalb des konischen Rohres vollständig verlängert werden.

Sichern Sie den Rest des Rattenkörpers in einem geeigneten Behälter, der mit der Mikro-CT-Stufe kompatibel ist. Legen Sie dann das gesicherte Gelenk in das Mikro-CT-Instrument und erfassen Sie zweidimensionale Bilder der Knochen im Gelenk mit Scannereinstellungen von 70 Kilovolt bei einem Strom von 85,5 Mikroangstroms und einer Auflösung von 11,5 Mikrometern für 180 Grad. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von fünf Sekunden bei 0,6 Grad Drehung. Sammeln Sie zweidimensionale Bilder, die sich alle 0,6 Grad durch die gesamten 180 Grad drehen. Rekonstruieren Sie dann die Bilder mit einem Algorithmus, um ein dreidimensionales Bild der Verbindung zu erstellen. Um die Trabekulären Knocheneigenschaften zu bestimmen, verwenden Sie zunächst ein Software-Plugin, um ein Volumen-Rendering des Gelenks zu erfassen.

Sehen Sie sich dann orthogonale Projektionen an und bewegen Sie sich durch Scheiben, um die gewünschte Position zwischen der epiphysealen Platte der medialen und seitlichen Tibialplateaus und den medialen und seitlichen Kondylen des Oberschenkelknochens auszuwählen. Als nächstes schneiden Sie das Knie an der gewünschten Stelle und maskieren Sie es mit einer 1,53-Millimeter-Kugel. Verwenden Sie die interaktive Schwellenwerterstellung, um den Bone zu beschriften und das Bild zu binarisieren. Berechnen Sie nun die trabekuläre Knochendicke, die eine Messung des Beginns der Arthrose ist.

Wiederholen Sie dies für verschiedene Positionen, und quantifizieren Sie andere trabekuläre Knocheneigenschaften. Nach der Bildgebung können Sie den ACL-Bruch durch visuelle Inspektion und durch Öffnen des Knies bestätigen. Um dies zu tun, entfernen Sie zuerst die Haut. Sie sollten eine Hemarthrose sehen, was bedeutet, dass sich Blut in der Kapsel befindet und charakteristisch für eine ACL-Verletzung ist.

Öffnen Sie nun das Gelenk weiter, um den vorderen distalen Oberschenkelknochen, die Patella und die ACL freizulegen. Führen Sie einen Lochman-Test durch, um das Gelenk noch weiter zu öffnen und Blut im Gelenk und den isolierten proximalen Riss der ACL zu beobachten.

Vergleichen wir nun die Gelenkdegeneration und die trabekkuläre Knochenstruktur in einem Rattenknie mit einer akuten ACL-Verletzung und einem Rattenknie vier Wochen nach der ACL-Verletzung. Hier sehen wir rekonstruierte 3D-Bilder eines Rattenknies mit einer akuten ACL-Verletzung und vier Wochen nach ACL-Verletzung. Die trabekuläre Knochendicke, -anzahl und -abstände werden an vier verschiedenen Stellen in der Mitte der epiphysischen Platte berechnet und verglichen.

Eine kleinere Trabecularzahl, reduzierte Trabekululardicke und ein größerer Trabecularabstand waren vier Wochen nach dem nichtinvasiven ACL-Riss im Vergleich zum Rattenknie mit einer akuten ACL-Verletzung zu beobachten. All dies sind charakteristische Merkmale des Beginns der posttraumatischen Arthrose.

Verschiedene Tiermodelle sind nicht nur für die Untersuchung der ACL-Verletzungen wichtig, sondern auch für die Bewertung neuer Behandlungen. Eine der aktuellen Behandlungen für ACL-Verletzungen ist die Bandrekonstruktion mit einem Gewebetransplantat. In dieser Studie, Forscher erstellt eine faserige Gewebetransplantat mit Polycaprolacton. Das azelluläre Transplantat wurde dann in Ratten implantiert und ersetzte das natürliche Band.

Das Transplantat wurde am Kniegelenk befestigt, indem Löcher in das Oberschenkelmur- und Tibialplateau gebohrt wurden, und dann das Transplantat durch die Löcher geleitet und mit Nähten gesichert wurde. Nach 16 Wochen zeigt die histologische Analyse, dass die Gerüstmatrix durch Fibroblasten infiltriert wurde und dass das Polymer weitgehend resosorbed wurde, ohne dass es übrig blieb. Technische Bänder können auch in vitro untersucht werden.

In dieser Studie wurden menschliche Zellen aus ACL-Überbleibseln isoliert und in der Kultur erweitert. Die Zellen wurden dann auf beschichteten Platten mit Ankern kultiviert, um konstruierte Bandkonstrukte zu bilden. Nach Zugabe von Fibrinogen zur Förderung der Fibrinbildung wurden die Platten in einem Inkubator kultiviert.

Nach 28 Tagen bildete das Fibrin lineares Gewebe zwischen den beiden Ankern. Diese Art von Studie ermöglicht es Forschern, die Rolle verschiedener Arten von Wachstumsfaktoren und Hormonen zu verstehen, ACL-Ersatzgewebe zu synthetisieren und Wege zu bestimmen, um ACL-Reparatur in vivo zu fördern.

Sie haben gerade Joves Einführung in die Verwendung eines Rattenmodells gesehen, um ACL-Verletzungen zu induzieren und zu visualisieren. Sie sollten nun verstehen, wie das Rattenmodell verwendet wird, um Bänderverletzungen zu untersuchen und abzubilden, und mehrere Anwendungen dieses Studienbereichs.

Danke fürs Zuschauen!

Results

Kleinere Trabecular-Zahl, reduzierte Trabekululardicke und größerer Trabecularabstand, alle markanten Merkmale des PTOA-Beginns, waren 4 Wochen nach dem nichtinvasiven ACL-Riss offensichtlich(Tabelle 1 und Abbildung 3). Abbildung 5zeigt ein Bild einer sezierten ACL von gesunder Gliedmaße im Vergleich zu einer akuten verletzten Gliedmaße . Das neuartige nicht-invasive Modell der ACL-Verletzung, bei dem die ACL durch eine einzige Last tibialer Kompression gebrochen wird, war in der Lage, einen isolierten proximalen Riss der ACL zu erzeugen.

Figure 4
Abbildung 3: 3-D rekonstruiertes CT-Bild einer akuten ACL-Verletzung (links) und 4 Wochen nach ACL-Verletzung (rechts) bei einer Ratte.

Tabelle 1: Charakteristische Messungen des PTOA-Beginns.

Tier Tb.N
(1/mm)
Tb.Th
(m)
TB.Sp
(m)
Akute ACL verletzt 3.11 168.5 217
4 wks post-ACL Verletzung 2.63 166.7 213

Figure 5
Abbildung 4: Bild einer akut verletzten ACL-Limb (links) und Bild einer intakten, gesunden ACL (rechts).

Applications and Summary

Dieses Video zeigt, wie ein linearer Aktuator verwendet werden kann, um einen isolierten nicht-invasiven ACL-Bruch bei Ratten zu erzeugen. Diese Verletzung repliziert die für den Menschen relevanten Verletzungsbedingungen und ist sehr reproduzierbar. Um einige der Haupteinschränkungen der traditionellen OA-Färbungstechniken zu überwinden, wird bei dieser Methode die gesamte Gelenkdegeneration und die trabekuläre Struktur mit der Methode "CT" quantifiziert.

Evidenzbasierte Interventionen zur Verbesserung der rehabilitativen Ergebnisse des Bewegungsapparates sind ein sehr bedeutsamer Bereich, der sich in den letzten zwei Jahrzehnten kaum verändert hat, obwohl signifikante Fortschritte in der Grundlagenbiologie darauf hindeuten, dass Änderungen der Rehabilitation Protokolle längst überfällig sind. Das Problem ist, dass klassische Rehabilitationsspezialisten anekdotische Berichte verwendet haben, um die klinische Praxis zu gestalten, anstatt die Grundlagenforschung, um fundierte Hypothesen zu liefern, die in Modellorganismen getestet werden, bevor sie in die Klinik übersetzt werden. Die hier beschriebenen Verfahren bieten Wissenschaftlern eine Methode, um eine traumatische Gelenkverletzung, die für den Menschen relevant ist, genau nachzubilden und das Fortschreiten der Gelenkgesundheit mit dem CT zu verfolgen.

Materialliste:

Ausrüstung Unternehmen Katalognummer Kommentare
Linearantrieb Phidgets L16-63-12-P
Wägezelle HDM Inc. PW6D
€€€€ Ct Zeiss XRM Xradia 520

References

  1. Maerz T, Kurdziel MD, Davidson AA, Baker KC, Anderson K, Matthew HW. Biomechanical Characterization of a Model of Noninvasive, Traumatic Anterior Cruciate Ligament Injury in the Rat. Ann Biomed Eng. 2015;43(10):2467-2476.
  2. Christiansen BA, Anderson MJ, Lee CA, Williams JC, Yik JH, Haudenschild DR. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(7):773-782.
  3. Lockwood KA, Chu BT, Anderson MJ, Haudenschild DR, Christiansen BA. Comparison of loading rate-dependent injury modes in a murine model of post-traumatic osteoarthritis. J Orthop Res. 2014;32(1):79-88.
  4. Blair-Levy JM, Watts CE, Fiorentino NM, Dimitriadis EK, Marini JC, Lipsky PE. A type I collagen defect leads to rapidly progressive osteoarthritis in a mouse model. Arthritis Rheum. 2008;58(4):1096-1106.
  5. Mohan G, Perilli E, Kuliwaba JS, Humphries JM, Parkinson IH, Fazzalari NL. Application of in vivo micro-computed tomography in the temporal characterisation of subchondral bone architecture in a rat model of low-dose monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2011;13(6):R210.
  6. Jones MD, Tran CW, Li G, Maksymowych WP, Zernicke RF, Doschak MR. In vivo microfocal computed tomography and micro-magnetic resonance imaging evaluation of antiresorptive and antiinflammatory drugs as preventive treatments of osteoarthritis in the rat. Arthritis Rheum. 2010;62(9):2726-2735.

Nicht-invasive ACL-Verletzung

  1. Tragen Sie die richtige persönliche Schutzausrüstung. Sie können eine Atemmaske verwenden, aber es ist nicht obligatorisch für dieses Protokoll.
  2. Anästhesisieren Sie die Ratten mit einer Induktionskammer mit 5% Isofluran und 1 L/min Sauerstoff. Halten Sie den Fluss der Anästhesie mit über einen Nasenkegel mit 1 - 3% Isofluran und 500 ml/min Sauerstoff aufrecht. Wenn das Gerät nicht auf einem Rück- oder Tiefzugtisch aufgestellt ist, stellen Sie sicher, dass Das Abgas mit einem Tischsystem und Holzkohlefiltern aufgeräumt wird.
  3. Führen Sie eine Zehenklemme durch, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Tiefe des Anästhetikums erreicht wurde. Beachten Sie, dass es nicht notwendig ist, Augenschmiermittel aufzutragen, das Protokoll wird schnell durchgeführt (< 3 min) und es besteht ein minimales Risiko der Hornhauttrockenheit.
  4. Positionieren Sie das rechte Hinterglied bei 30° Dorsiflexion und 100° Kniebeugung und bieten Sie gleichzeitig Raum für eine vordere Subluxation der Tibia im Vergleich zum Oberschenkelknochen.
  5. Montieren Sie die obere Kniestufe starr an einem Linearantrieb.
  6. Positionieren Sie das gebeugte Knie auf der unteren Stufe, die direkt über einer Wägezelle montiert ist.
  7. Induzieren Sie ACL-Verletzungen mit einer einzigen Last von tibialer Kompression mit einer Geschwindigkeit von 8 mm/s.
  8. ACL-Verletzungen werden durch eine Freisetzung von Druckkraft festgestellt. Dies wird über ein benutzerdefiniertes Programm überwacht.
  9. Nach der Verletzung, während das Tier noch unter der Ebene der Anästhesie ist, führen Sie einen Lachman-Test durch, um klinisch zu bestätigen, dass ein ACL-Ruptur aufgetreten ist. Ein Lachman-Test ist ein klinischer Test, der verwendet wird, um die Integrität der ACL zu bewerten, indem die Stabilität des sagittalen Plans bewertet wird. Während der Stabilisierung des Oberschenkelknochens ziehen Sie die Tibia nach vorne (in vorderer Richtung), um die Menge der Bewegung zu beurteilen. Eine intakte ACL erzeugt ein "festes Endgefühl", bei dem der Forscher nicht in der Lage sein wird, die Tibia vorwärts zu übersetzen. Eine verletzte ACL erzeugt ein "weiches oder matschiges Endgefühl", was auf eine zerrissene ACL hindeutet.
  10. Palpate den Oberschenkelknochen und Tibia, um alle groben Knochenschäden zu erkennen. Wenn keine Kontraindikationen festgestellt werden, überführen Sie das Tier in seinen Käfig und lassen Sie es sich erholen. Während dieser Zeit, überwachen Sie das Tier, um sicherzustellen, dass es keine Anzeichen von Schmerzen zeigt, wie z. B. eine Abneigung gegen Bewegung, Stimmbildung oder abnorme Haltung.

CT-Bildgebung der Gelenkdegeneration

2D-Bilder werden mit Scannereinstellungen von 70 kV, Strom 85,5 A(Abbildung 2B) erhalten. Die Daten werden jeden 0,6°-Drehschritt mit einer Auflösung von 11,5 m bis zu einer Gesamtauflösung von 180° erhoben. Querschnittsbilder werden mit einem geglätteten Rückprojektionsalgorithmus und auf dem Stapel rekonstruierter Bilder rekonstruiert (Abbildung 2C). Die Trabekuläre Struktur wird dann durch Segmentierung in Software analysiert, wobei eine 1,53 mm Kugel in der epiphysealen Platte der medialen und seitlichen Tibialplateaus und des Oberschenkelknochens zentriert ist, um die trabekuläre Dicke (m), die Trabeekulartrennung (m) und die Trabekularzahl (1/mm) zu bestimmen. 5,6

  1. Nach 4 Wochen nach der ACL-Verletzung die Ratte mit längerer CO2-Exposition in der Induktionskammer einschläfern.
  2. Erweitern und sichern Sie ACL verletzte hinterlimb in einem benutzerdefinierten 3D-gedruckten Gerät (Abbildung 2A).
  3. Erfassen Sie Bilder mit dem Wert von 'CT.
  4. Besorgen Sie sich frontale Ebenenröntgenaufnahmen, um den gemeinsamen Raum zu bestimmen. Verengung (zwischen dem femoralen Kondyle und dem Tibiaplateau [gemessen in mm]) im Vergleich zur nicht verletzten Gliedmaße.
  5. Erhalten Sie 2D-Bilder mit den folgenden Scannereinstellungen: 70 kV und Strom 85,5 A.
  6. Sammeln Sie die Daten jeden 0,6°-Drehschritt bei einer Pixelgröße von 11,5 m bis hin zu einem kompletten 180°.
  7. Rekonstruieren Sie Querschnittsbilder mit einem geglätteten Rückprojektionsalgorithmus auf dem Stapel rekonstruierter Bilder.
  8. Um einen konsistenten Interessenbereich zu messen, legen Sie eine 1,53 mm Kugel in die epiphyseale Platte der medialen und seitlichen Tibialplateaus und des Oberschenkelknochens, um die trabekuläre Dicke (m), die Trabekulartrennung (m) und die Trabekkulärzahl (1/mm) zu bestimmen.

Figure 2
Abbildung 2: A) Benutzerdefiniertes gedrucktes Gerät zur Ablage während der 2D-Bilder von CT, B und C) 3-D-CT.

Eine der häufigsten Knieverletzungen ist der Bruch oder Riss des vorderen Kreuzbandes, auch ACL genannt, mit fast einem Drittel der ACL-Verletzungen, die innerhalb eines Jahrzehnts zu posttraumatischen Arthrose oder PTOA führen.

Rattenmodelle wurden ausgiebig verwendet, um die Wirkung von ACL-Verletzungen auf PTOA zu untersuchen, da das Kniegelenk der Ratte ein enges Modell zum menschlichen Kniegelenk ist. Das am weitesten verbreitete Modell der ACL-Verletzung ist aCL-Transektion, bei der das Gelenk operativ destabilisiert wird. Dieses Modell repliziert jedoch nicht genau aCL-Verletzungsbedingungen beim Menschen.

In diesem Video werden wir ein neuartiges, nicht-invasives ACL-Verletzungsmodell für Ratten besprechen, die Verletzung und Bildgebung von verletzten Gelenken demonstrieren und schließlich die Forschung im Bereich der biomedizinischen Technik zur Bandreparatur überprüfen.

Das Knie besteht aus drei Knochen, dem Oberschenkelknochen, der Patella und der Tibia. Das vordere Kreuzband(ACL) ist eine bandartige Struktur aus dichtem Bindegewebe, die aus dem vorderen interkondylaren Raum der Tibia aufsteigt und sich überlegen und seitlich auf den hinteren Aspekt des seitlichen Kondyskose des Oberschenkelknochens erstreckt.

Die anderen Bänder im Knie sind das hintere Kreuzband, das laterale Kollateralband und das mediale Kollateralband. Strukturell dienen alle Bänder, insbesondere die ACL, als passive Stabilisatoren des Knies zusammen mit der Oberschenkelmuskulatur, um das Gelenk während der dynamischen Bewegung zu kontrollieren.

Die größte Belastung für die ACL tritt auf, wenn das Knie in der Nähe der Verlängerung ist, und es ist während dieser Zeit, dass die ACL ist mit dem höchsten Verletzungsrisiko. Tiermodelle bieten sowohl eine praktische als auch eine klinisch relevante Möglichkeit, Gelenkverletzungen und Behandlungen zu untersuchen. Insbesondere das Rattenkniemodell wird häufig zur Untersuchung von Knieverletzungen verwendet, da das Rattenknie dem menschlichen Knie sehr ähnlich ist. Um eine klinisch relevante ACL-Verletzung beim Menschen zu modellieren, wird eine einzige Last der tibiaellen Kompression angewendet. Wenn dies richtig durchgeführt wird, führt dies zu einem vollständigen Bruch der ACL.

ACL-verletzte Hinterglieder können dann mit Mikro-Computertomographie oder Micro CT abgebildet werden, um Gelenkverletzungen und Degeneration zu visualisieren. Micro CT ist eine bildgebende Technik, die Röntgenstrahlen verwendet, um Bilder eines Objekts zu erstellen, wie ein Gelenk. Diese Querschnitte werden über das Objekt hinweg gemessen und zu einer dreidimensionalen Rekonstruktion kombiniert. Weitere Informationen zu micro CT finden Sie im Video dieser Sammlung.

Nun, da wir das neuartige, nicht-invasive ACL-Verletzungsmodell der Ratte diskutiert haben, werfen wir einen Blick darauf, wie die Verletzung durchgeführt wird, gefolgt von einer Mikro-CT-Visualisierung des Gelenks.

Die ACL-Verletzung wird mit einem benutzerdefinierten Gerät durchgeführt, das eine einzelne Last der Kompression auf die Tibia einer anästhesierten Ratte induziert. Legen Sie zunächst eine Ratte in eine Induktionskammer mit fünf Prozent Isofluran und einem Liter sauerstoffreiche Minund. Nach der Beägung bewegen Sie die Ratte mit einem Nasenkegel auf das Gerät, um einen Fluss von ein bis drei Prozent Isofluran aufrechtzuerhalten. Positionieren Sie die rechte Hintergliedmaße bei 30 Grad Dorsaflexion und 100 Grad Kniebeugung.

Bewegen Sie die obere Kniestufe, die an einem Linearantrieb befestigt ist, mit einem Millimeter pro Sekunde. Achten Sie darauf, Platz für die vordere Subluxation der Tibia, relativ zum Oberschenkelknochen, zu schaffen. Positionieren Sie dann das gebeugte Knie auf der unteren Stufe, das über eine Wägezelle gerichtet montiert ist. Sobald die Ratte richtig positioniert ist, schalten Sie das benutzerdefinierte Gerät ein, öffnen Sie die Lab-Ansicht, und geben Sie eine Komprimierungsgeschwindigkeit von acht Millimetern pro Sekunde ein. Führen Sie dann den Test aus, um einen ACL-Ruptur mit einer einzigen Last der tibialen Kompression auszulösen. Überwachen Sie beim Ausführen des Tests die Prozedur. Die ACL-Verletzung wird durch die Freisetzung von Druckkraft festgestellt.

Nach der Verletzung, entfernen Sie die Ratte aus dem Gerät und legen Sie sie auf eine flache Oberfläche. Führen Sie dann Lachmans Test durch, um die Integrität der ACL zu bewerten. Während der Stabilisierung des Oberschenkelknochens, ziehen Sie die Tibia nach vorne. Eine intakte ACL erzeugt einen festen Endpunkt, während eine verletzte ACL ein weiches Endgefühl erzeugt. Sobald Lachmans Test durchgeführt wurde, kehren Sie die Ratte in ihr Gehäuse zurück, damit sie aus der Anästhesie aufwachen kann.

Lassen Sie uns nun das beschädigte Gelenk abbilden. Um sich auf mikroct-Bildgebung vorzubereiten, euthanisieren Sie die Ratte auf humane Weise gemäß AVMA-Richtlinien. Dann verlängern und sichern Sie die ACL-verletzten Hinterbeine mit mehreren Kunststoff-Reißverschluss-Krawatten, und sorgfältig manövrieren sie in das benutzerdefinierte Gerät. Die Hintergliedmaße sollte innerhalb des konischen Rohres vollständig verlängert werden.

Sichern Sie den Rest des Rattenkörpers in einem geeigneten Behälter, der mit der Mikro-CT-Stufe kompatibel ist. Legen Sie dann das gesicherte Gelenk in das Mikro-CT-Instrument und erfassen Sie zweidimensionale Bilder der Knochen im Gelenk mit Scannereinstellungen von 70 Kilovolt bei einem Strom von 85,5 Mikroangstroms und einer Auflösung von 11,5 Mikrometern für 180 Grad. Verwenden Sie eine Belichtungszeit von fünf Sekunden bei 0,6 Grad Drehung. Sammeln Sie zweidimensionale Bilder, die sich alle 0,6 Grad durch die gesamten 180 Grad drehen. Rekonstruieren Sie dann die Bilder mit einem Algorithmus, um ein dreidimensionales Bild der Verbindung zu erstellen. Um die Trabekulären Knocheneigenschaften zu bestimmen, verwenden Sie zunächst ein Software-Plugin, um ein Volumen-Rendering des Gelenks zu erfassen.

Sehen Sie sich dann orthogonale Projektionen an und bewegen Sie sich durch Scheiben, um die gewünschte Position zwischen der epiphysealen Platte der medialen und seitlichen Tibialplateaus und den medialen und seitlichen Kondylen des Oberschenkelknochens auszuwählen. Als nächstes schneiden Sie das Knie an der gewünschten Stelle und maskieren Sie es mit einer 1,53-Millimeter-Kugel. Verwenden Sie die interaktive Schwellenwerterstellung, um den Bone zu beschriften und das Bild zu binarisieren. Berechnen Sie nun die trabekuläre Knochendicke, die eine Messung des Beginns der Arthrose ist.

Wiederholen Sie dies für verschiedene Positionen, und quantifizieren Sie andere trabekuläre Knocheneigenschaften. Nach der Bildgebung können Sie den ACL-Bruch durch visuelle Inspektion und durch Öffnen des Knies bestätigen. Um dies zu tun, entfernen Sie zuerst die Haut. Sie sollten eine Hemarthrose sehen, was bedeutet, dass sich Blut in der Kapsel befindet und charakteristisch für eine ACL-Verletzung ist.

Öffnen Sie nun das Gelenk weiter, um den vorderen distalen Oberschenkelknochen, die Patella und die ACL freizulegen. Führen Sie einen Lochman-Test durch, um das Gelenk noch weiter zu öffnen und Blut im Gelenk und den isolierten proximalen Riss der ACL zu beobachten.

Vergleichen wir nun die Gelenkdegeneration und die trabekkuläre Knochenstruktur in einem Rattenknie mit einer akuten ACL-Verletzung und einem Rattenknie vier Wochen nach der ACL-Verletzung. Hier sehen wir rekonstruierte 3D-Bilder eines Rattenknies mit einer akuten ACL-Verletzung und vier Wochen nach ACL-Verletzung. Die trabekuläre Knochendicke, -anzahl und -abstände werden an vier verschiedenen Stellen in der Mitte der epiphysischen Platte berechnet und verglichen.

Eine kleinere Trabecularzahl, reduzierte Trabekululardicke und ein größerer Trabecularabstand waren vier Wochen nach dem nichtinvasiven ACL-Riss im Vergleich zum Rattenknie mit einer akuten ACL-Verletzung zu beobachten. All dies sind charakteristische Merkmale des Beginns der posttraumatischen Arthrose.

Verschiedene Tiermodelle sind nicht nur für die Untersuchung der ACL-Verletzungen wichtig, sondern auch für die Bewertung neuer Behandlungen. Eine der aktuellen Behandlungen für ACL-Verletzungen ist die Bandrekonstruktion mit einem Gewebetransplantat. In dieser Studie, Forscher erstellt eine faserige Gewebetransplantat mit Polycaprolacton. Das azelluläre Transplantat wurde dann in Ratten implantiert und ersetzte das natürliche Band.

Das Transplantat wurde am Kniegelenk befestigt, indem Löcher in das Oberschenkelmur- und Tibialplateau gebohrt wurden, und dann das Transplantat durch die Löcher geleitet und mit Nähten gesichert wurde. Nach 16 Wochen zeigt die histologische Analyse, dass die Gerüstmatrix durch Fibroblasten infiltriert wurde und dass das Polymer weitgehend resosorbed wurde, ohne dass es übrig blieb. Technische Bänder können auch in vitro untersucht werden.

In dieser Studie wurden menschliche Zellen aus ACL-Überbleibseln isoliert und in der Kultur erweitert. Die Zellen wurden dann auf beschichteten Platten mit Ankern kultiviert, um konstruierte Bandkonstrukte zu bilden. Nach Zugabe von Fibrinogen zur Förderung der Fibrinbildung wurden die Platten in einem Inkubator kultiviert.

Nach 28 Tagen bildete das Fibrin lineares Gewebe zwischen den beiden Ankern. Diese Art von Studie ermöglicht es Forschern, die Rolle verschiedener Arten von Wachstumsfaktoren und Hormonen zu verstehen, ACL-Ersatzgewebe zu synthetisieren und Wege zu bestimmen, um ACL-Reparatur in vivo zu fördern.

Sie haben gerade Joves Einführung in die Verwendung eines Rattenmodells gesehen, um ACL-Verletzungen zu induzieren und zu visualisieren. Sie sollten nun verstehen, wie das Rattenmodell verwendet wird, um Bänderverletzungen zu untersuchen und abzubilden, und mehrere Anwendungen dieses Studienbereichs.

Danke fürs Zuschauen!

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