ELISPOTアッセイ:IFN-γ分泌脾細胞の検出

Immunology

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Concepts

ソース: トーニャ・J・ウェッブ1
1メリーランド大学医学部微生物学・免疫学科、マーリーン・スチュワート・グリーンバウム総合癌センター、ボルチモア、メリーランド州 21201

ELISPOTは、細胞の免疫応答を検出するために使用される標準化された、再現可能なアッセイです。このアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)ベースの方法を利用して、スポットで可視化できる単細胞免疫応答を検出し、ELISPOTという名前を付けます。ELISPOTは、1983年に、チェルキンスキーによって、抗原特異的免疫グロブリンを産生するB細胞ハイブリドーマの数を列挙する方法として説明された(1)。同じグループはさらに、Tリンパ球を産生するサイトカインの頻度を測定するアッセイを開発した。現在、ELISPOTは臨床試験やワクチン候補における抗原特異的T細胞免疫を測定するためのゴールドスタンダードとなっています。例えば、ワクチン接種後または感染中に、血漿細胞および記憶B細胞は保護を提供する抗体を分泌する。典型的には、これらのB細胞応答は、抗原特異的抗体の血清定量子を測定することによって評価される。しかしながら、このタイプの分析は、典型的にはELISAによって測定され、記憶B細胞を含んでおらず、検出可能な血清抗体レベルがない場合でも存在しうる。さらに、循環記憶B細胞は病原体再曝露後に観察される迅速かつ保護抗体応答にとって重要であることが確立されており、したがって、これらの細胞を検出できることが重要である。したがって、抗原特異的記憶B細胞応答を明確に評価するために、ELISAとELISPOTの両方を使用すべきである(2)。

ELISPOTアッセイは、目的の分泌されたタンパク質を捕捉するために抗体でコーティングされた膜裏地を含むプレートを使用しています。次いで、プレートに細胞と刺激をロードしてタンパク質産生を誘導する。分泌されたタンパク質は、表面にコーティングされた抗体によって捕捉されます。適切なインキュベーション時間の後、細胞が除去され、分泌された分子は、捕捉抗体と比較して、異なるエピトープに特異的であるビオチン化抗体を使用して検出される。次に、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを添加し、続いてスポットの検出を可能にする基板を添加する(図1)。このアッセイの強さは、目的のタンパク質を産生する細胞の数を定量化する可能性がある。重要なのは、特定のタンパク質を産生する細胞の総数に変化があるかどうか、または集団内の個々の細胞がより多くのタンパク質を産生しているかどうかを評価できることです。さらに、運動学に関する情報を提供することができ、抗原特異的応答(抗原シミュレーション)に対する全体的な免疫活性化(ミトゲン刺激)を評価するために使用することができます。ELISPOTアッセイは、ミト原性または抗原特異的活性化後の300,000細胞中の1つの活性化細胞の検出を可能にします。

Figure 1
図 1: ELISPOT プロトコルの概要。

このアッセイの主な利点は、その単純さ-プロトコルは比較的簡単で簡単です。技術的な専門知識を必要とせず、b. 感度- それは単一細胞レベルで免疫細胞の検出を可能にし、フローサイトメトリーなどの他の方法と比較して非常に少数の細胞を必要とする、 c. 機能性- それは免疫に関する定量的データを提供します関数。

このラボ演習では、IFN-γ分泌脾細胞の検出のためのELISPOTプロトコルを示していますが、上記のアッセイとして、B細胞による抗体分泌を評価するためにも使用できます(3)。

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JoVE Science Education Database. 免疫 学. ELISPOTアッセイ:IFN-γ分泌脾細胞の検出. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. セットアップ

バッファーと試薬

  1. カルシウムまたはマグネシウムを使用せずに生菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)
  2. コーティングバッファー- 滅菌PBSまたは炭酸塩バッファーのいずれか
  3. PBSにおけるアッセイ希釈剤- 10%胎児ウシ血清(FBS)
  4. 細胞培養培地- 10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびL-グルタミンを含むRPMI 1640
  5. 洗浄バッファー- 0.05% Tween20 を含む PBS
  6. 二重蒸留水(ddH2O)
  7. 検出基板-100mg AEC(3-アミノ-9-エチルカルバゾール)を10mL DMF(N,N,ジメチルホルミド)で検出した。

機器

  1. ラミナーフローフード
  2. 加湿インキュベーター(37°C、5%CO2に設定)
  3. 自動ELISPOTリーダーまたは解剖顕微鏡

材料

  1. エリスポットプレート
  2. 滅菌および非滅菌貯留所
  3. ピペッタとヒント
  4. 滅菌血清ピペット
  5. 滅菌、円錐状ポリプロピレンチューブ
  6. プレート洗浄用スクイーズボトル2本

アッセイ特異的試薬

  1. 細胞-一次細胞または細胞株(ここでは、C57BL/6マウス由来の脾細胞を用いた)
  2. 覚醒剤-ミトゲンまたは抗原(ここでは、ソルボル12-ミリステート13-アセテート(PMA、50ng/mL)およびイオノマイシン(1μM)を用いた。
  3. 一次抗体-ビオチン化抗サイトカイン検出抗体(アッセイ希釈剤で2μg/mLに希釈)
  4. 二次抗体- ストレプトアビジン-ワサビ性ペルオキシダーゼ(SAv-HRP)

2. 手続き

コーティング

  1. 条件を無菌および層状流フードの中に保ち、精製された抗サイトカイン捕捉抗体を無菌コーティングバッファー内の0.5-4.0 μg/mLの最終濃度に希釈する。(注:IFN-γおよびIL-6の場合は5 μg/mLを使用)。
  2. 捕捉抗体溶液100μL/ウェルをELISPOTプレートに移します。
  3. プレートカバーでプレートを覆い、蒸発を防ぐためにシールします。
  4. プレートを4°Cで一晩インキュベートします。

ブロック

  1. 翌日、層流フードにELISPOTプレートを発見。プレートを滅菌ワイプに素早く反転させ、各ウェルから捕捉抗体溶液を除去します。
  2. 次に、各ウェルに200μLの細胞培養培地を添加する。このステップは、アッセイ中に非特異的結合をブロックします。
  3. プレートカバーを交換し、37°Cで2時間インキュベートします。

めっきと細胞の活性化

  1. プレートがインキュベートされている間、細胞培養培地中に50ng/mL PMAおよび1μMイオノマイシンを含む2Xマイトゲン溶液を調出す。
  2. 次いで、標的細胞懸濁液を2x106細胞/mLのストック濃度に調出する。
  3. インキュベーションが完了したら、層流フード内の無菌ワイプにプレートを素早く反転させ、各ウェルから細胞培養培地を取り除きます。
  4. 次に、ストックセル懸濁液の2Xシリアル希釈を生成する。そうするには、まずELISPOTプレートの一番上の行のウェルに、準備された細胞懸濁液ストック溶液の200 μLを追加します。
  5. 次に、細胞ストック溶液を含む行の下のプレートの次の5行にプレーン細胞培地の100 μLを加える。
  6. その後、一番上の行から直下の行にセルラー懸濁液の100 μLをピペッティングして2Xシリアル希釈を行います。この溶液を上下にゆっくりとピペッティングして適切な混合を行い、セルの分配を均等にします。
  7. 残りの 4 行に対してこのプロセスを繰り返します。
  8. 6 行目はカルチャ メディアのみに残します。これは、実験的な制御として機能します。
  9. 次に、準備されたマイトゲン溶液の100 μLをプレートの最初の5列の実験井戸に加える。制御ウェルと6列目に、マイトゲンを含まない細胞培養培養培養剤の100μLを添加する。
  10. プレートカバーを交換し、プレートを37°C、5%CO2をインキュベーターで20~48時間交換します。(注:20~24時間は通常、IL-2およびTNF-αを検出するのに十分ですが、IL-4およびIFN-γには48時間が最適です。

検出

一次抗体

  1. アッセイ希釈剤中の2μg/mLの濃度に対する抗体を検出するバイオチン化抗サイトカインを調製する。
  2. PBSで0.05%のTween-20を混合することにより、この時点で洗浄バッファーの20〜25 mLを調製します。
  3. インキュベーションが完了したら、プレートのキャップを外し、シンクの上に素早く反転して、井戸からすべての液体を除去します。(注:この時点の後、プレートはもはや無菌状態に保つ必要はありません)。
  4. 次いで、各ウェルに〜200μL洗浄バッファーを加えてプレートを洗浄する。この液体を素早く反転させ、シンクの上にプレートをフリックして排出します。合計 5 回の洗い流しの場合は、このプロセスを繰り返します。
  5. 次に、希釈されたビオチン化抗サイトカイン検出抗体溶液を各ウェルに100μLを添加する。室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。

二次抗体

  1. インキュベーションが完了したら、シンク上のプレートを反転してフリックして検出抗体を排出します。
  2. 前と同様に、プレートを〜200μL洗浄バッファーで5回洗浄し、各洗浄の間に液体を排出する。
  3. 次に、希釈されたストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに100μL添加する(アッセイ希釈剤で予め決定された最適濃度に希釈)。
  4. プレートカバーを交換し、室温で37°Cで1.5~2時間インキュベートします。

基板

  1. インキュベーション後、使用の15分以内に、まずメーカーの指示に従ってAEC基板溶液を活性化する。
  2. 次に、井戸の中身を捨て、以前と同様に洗浄バッファーでプレートを5回洗浄します。
  3. 次に、直ちに各ウェルに100μLのAEC基板溶液を添加する。
  4. スポットの発達を監視しながら、室温でプレートを10~20分間インキュベートします。
  5. プレートを水ですすいで、流しの上でプレートをフリックして反応を止めます。
  6. ペーパータオルにプレートをブロットし、プレートが一晩または完全に乾燥するまで乾燥させます。プレートの下のプラスチックトレイを取り外すと、乾燥が容易になります。

3. データ取得・分析

  1. 乾燥後、スポットは自動プレートリーダーでカウントする準備ができています。ここでは、CTL免疫スポットリーダーが使用されるが、このプロトコルは、任意のリーダーに適合させることができる。
  2. まず楽器の電源を入れ、次にコンピュータの電源を入れます。次に、CTLプログラムを開き、「スキャンカウント」をクリックします。
  3. トレイを「イジェクト」押してマシンから伸ばします。次に、プラスチック製のアダプターを取り外し、ELISPOTプレートとアダプターの行「A」を揃えます。
  4. 保存するファイル名と場所を選択し、プレートをトレイにロードします。
  5. 次に、ソフトウェアの「ロード」をクリックし、マシンの側面にあるドアを閉じます。
  6. 「カウント後開始」を押します。ファイルが保存されていることを確認し、品質管理「QC」ソフトウェアを開いてデータを分析し、スポット数をカウントします。

ノート:

  1. 細胞の最小数は、予備実験で決定する必要があります。最適なスポット数は~50/ウェルです。読み込まれるセルが多すぎると、個別のスポットを検出するのが難しくなります。さらに、細胞は重なり合い、膜上に単層を形成しない可能性があるため、検出のレベルが低下する可能性があります。
  2. 実験を最適化する際には、標的タンパク質の期待発現レベルを考慮する。発現が低いほど、ウェルあたりに必要なセル数が多くなります。
  3. ELISAとは異なり、プレートウォッシャーを使用するよりも、プレートを手洗いする方が良いです。ELISPOTプレートはより繊細であり、PVDF膜の穿刺を避ける必要があります。
  4. スポットが汚れる可能性があるため、インキュベーション期間中のプレートの動きを制限する必要があります。
  5. 直接光にさらされるとスポットがフェードするので、プレートは暗闇の中に保管する必要があります。

酵素結合免疫スポット、またはELISPOTアッセイは、病原体または細胞損傷に対する免疫応答を分析する方法である。それは彼らが分泌する特定のタンパク質を検出することによって異なる免疫細胞の活性化の定量化を可能にする。例えば、ELISPOTは、分泌されたサイトカインを検出することにより、外来抗原に曝露した際のT細胞応答を測定するために一般的に使用される。

サイトカインベースのELISPOTアッセイの場合、プロセスは標的サイトカインに特異的である捕捉抗体を用いたELISPOTマイクロプレートのコーティングから始まります。抗体コーティング後、T細胞をウェルに添加し、例えば抗CD3抗体のような外部薬剤によって刺激される。細胞は、その後、捕捉抗体によって直ちに固定化される標的サイトカインを分泌する。タンパク質は生細胞からの分泌後即座に捕捉されるので、希釈や分解を行うことなく、このアッセイは高精度です。標的サイトカインが固定化されると、検出抗体が追加され、捕捉されたサイトカインにも結合する。

ELISPOT技術は、特定の抗体の産生を分析することにより、感染またはワクチン接種後の記憶B細胞を定量化するためにも使用することができる。抗体ベースのELISPOTでは、抗体の代わりに特定の抗原が使用され、抗原がプレートに結合するか、検出ステップで抗原が標的抗体ポストキャプチャを検出します。プロセスのすべてのバリエーションにおいて、T細胞またはB細胞に対して、検出抗体または抗原はビオチン化され、ワサビペペキシダーゼなどのストレプトアビジン結合検出酵素に結合することを可能にする。そして、ペルオキシダーゼの基質を添加すると、AEC、暗く、不溶性の沈殿物が生成される。この沈殿物は、捕捉されたタンパク質の位置をマークし、各分泌細胞は、ELISPOTリーダーまたは顕微鏡を使用して定量することができる目に見えるスポットをもたらします。スポットの大きさは、各細胞から分泌されるタンパク質の量の相対的な推定値です。このアッセイは、分泌細胞の比較的小さな亜集団においても、単一細胞からの免疫応答を検出することができ、細胞レベルでの免疫応答の研究に有用である。

このビデオでは、ELISPOT アッセイを実行し、分泌細胞を表すスポットを定量する方法を学習します。

実験を通して、層流フードで働き、手袋を着用することによって無菌状態を保障する。

このプロトコルのすべての計算は、1つの96ウェルプレートに必要なボリュームに基づいています。

まず、抗サイトカイン捕捉抗体を希釈する。これを行うには、無菌の15ミリリットルの円錐形チューブにバッファの10ミリリットルを転送します。次に、ピペットを使用してモノクローナル抗体1ミリリットル当たり10マイクロリットルをバッファーに追加し、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度の溶液を作成します。次に、捕捉抗体溶液を無菌貯留槽に注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルELISPOTプレートの各ウェルに100マイクロリットルを分配する。

プレートカバーでプレートを覆い、蒸発を防ぐためにシールし、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、層流フードにELISPOTプレートを発見。プレートを滅菌ワイプに素早く反転させ、各ウェルから捕捉抗体溶液を除去します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに200マイクロリットルの細胞培養培地を追加します。このステップは、アッセイ中に非特異的結合をブロックします。プレートカバーを交換し、37°Cのインキュベーターで2時間インキュベートします。

プレートがインキュベートされている間、1マイクロリットルのPMAと20マイクロリットルのイオノマイシンを10ミリリットルの細胞培養培地に加えて2倍のマイトゲン溶液を調製し、1ミリリットルPMAあたり15ナノグラムの最終濃度と1マイクロモルイオノマイシンを達成する。

マウス脾細胞の細胞懸濁液も滅菌フードでこの時点で調製する必要があります。顕微鏡と血球計を用いて細胞の濃度を測定し、1ミリリットル当たり200万個の細胞のストック濃度に達するまで総体積を調整する。

インキュベーションが完了したら、プレートを無菌ワイプに素早く反転させ、各ウェルから細胞培養培地を除去する。次に、ELISPOTプレートの一番上の行のウェルに、準備されたセルラー懸濁液ストック溶液の200マイクロリットルを追加します。テストを三つ三つ三つ三つに設定し、テストした各セルタイプが3つのグループ化された列のセットにメッキされます。この下に、100マイクロリットルのプレーン細胞培地をプレートの次の5列に加え、細胞ストック溶液を含む行の下に加える。

次に、セル懸濁液の100マイクロリットルを一番上の行から真下の行にピペッティングし、溶液を上下に優しく配管して細胞を均等に分配することによってシリアル希釈を行う。残りの行に対してこのプロセスを繰り返し、前の行から各ステップの下の行に 100 マイクロリットルを移動し、5 行目が連続的に希釈されるまで続けます。6列目を細胞培養培地のみで残し、コントロールとして機能させる。プレートの実験井戸内の細胞を刺激するために、準備されたマイトゲン溶液の100マイクロリットルを行1〜5の各ウェルの細胞懸濁液に加える。コントロールとして機能する6行目を刺激しないで残してください。蓋を交換し、プレートを摂氏37度、CO25%で24~48時間インキュベートします。

希釈されたビオチン化抗サイトカイン検出抗体を調製する。まず、PBSの45ミリリットルに10%のウシ血清の5ミリリットルを添加することにより、希釈アッセイの50ミリリットルを調製する。次に、検出抗体をアッセイ希釈剤で1ミリリットル当たり2マイクログラムの濃度に希釈する。また、このとき洗浄バッファーの20〜25ミリリットルを調製し、.05%のTween-20とPBSを混合して調製する。

インキュベーションが完了したら、プレートのキャップを外し、すぐに反転して井戸からすべての液体を除去します。各井戸に約200マイクロリットルの洗浄バッファーを追加してプレートを洗浄します。この液体を素早く反転させ、シンクの上にプレートをフリックして排出します。このプロセスをさらに 4 回繰り返し、合計 5 回の洗い流しを行います。次に、希釈検出抗体溶液の100マイクロリットルを各ウェルに加え、蓋を交換し、室温で2時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートをシンク上に反転してフリックすることにより、プレートのウェルから検出抗体溶液を排出する。

前と同様に、洗浄バッファーでプレートを5回洗浄し、各洗浄の間に液体を排出する。最終洗浄後、製造元の指示に従って希釈してストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼ溶液を調製する。次に、プレートの井戸を空にして、希釈されたストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに100マイクロリットルを加える。蓋をプレートに戻し、室温で2時間インキュベートします。

インキュベーション後、使用の15分以内に、あらかじめ作られたAEC基板溶液を活性化する。井戸の中身を捨て、以前と同様に洗浄バッファーで5回洗浄します。次に、直ちに各ウェルに100マイクロリットルのAEC基板溶液を添加する。プレートを室温のままにし、スポットの発達を監視しながら約10~20分間開発します。これらのスポットは、井戸の表面に小さく暗い円として表示されます。その後、水でプレートをすすいで、シンクの上にそれをフリックすることによって、反応を停止します。ペーパータオルの上にプレートをブロットし、一晩または完全に乾燥するまで空気乾燥を可能にします。プレートの下のプラスチックトレイを取り外すと、乾燥が容易になります。乾燥後、スポットは自動プレートリーダーでカウントする準備ができています。

ここでは、CTL ImmunoSpotリーダーが使用されますが、このプロトコルは任意のリーダーに適合させることができます。次に、CTLプログラムを開き、スキャンカウントをクリックします。トレイのイジェクトを押して、マシンから伸ばします。次に、プラスチック製のアダプターを取り外し、ELISPOT プレートとアダプターの行 A を揃えます。ファイルを保存するファイル名と場所を選択し、プレートとアダプタをトレイにロードします。ソフトウェアのロードをクリックし、マシンの側面にあるドアを閉じます。次に、[カウント後に開始] を押します。ファイルが保存されていることを確認し、品質管理QCソフトウェアを開いてデータを分析し、スポットの数をカウントします。このデータを Excel ファイルとしてエクスポートします。解析が完了したら、[射出] をクリックしてプレートを取得します。

この実験では、野生型および腫瘍を有するマウスの細胞をめっきし、IFNガンマについて分析した。細胞濃度が低下するとスポット数が減少します。通常、ELISPOTデータは、めっきされたセル数あたりのスポット数として表示されます。この例では、スポットの数を棒グラフに表示し、それぞれの細胞濃度を X 軸に一覧表示しました。スポットの数は、特定の母集団内のセルの合計数あたりのアクティブ化されたセルの数を示していることに注意してください。

Results

このELISPOTアッセイでは、野生型および腫瘍性マウス由来の脾臓白血病をIFN-γについて分析した。図2は、アッセイ結果の視覚画像を示す。緑色の数字は、ウェルあたりのスポット数を示します(TNTCは「数えるには数えきれない」ことを示します)。細胞濃度が低下するとスポット数が減少します。

Figure 2A
図2A:腫瘍を有するマウスにおける免疫応答の減少この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

通常、ELISPOTデータは、めっきされたセル数あたりのスポット数として表示されます。図 2 B では、スポット数が棒グラフに表示され、それぞれのセルラー濃度が X 軸に表示されます。グラフ作成のために、150 はスポットの最大数を示すために使用されました。腫瘍を有する動物におけるマウス脾臓白血病産生IFN-γの数は、野生型のものよりも低い。

Figure 2B
図2B:腫瘍を有するマウスにおける免疫応答の減少脾細胞は対照C57BL/6(野生型)および腫瘍性マウスから採取し、PMA/イオノマイシンで48時間刺激した。ELISPOTアッセイは、IFN-γ産生脾臓白血病の数を定量するために使用された。(A) データの視覚的および (B) グラフィカルな表現。TNTC はカウントする数が多すぎることを示します。グラフ作成のために、150 はスポットの最大数を示すために使用されました。緑色の数字は、ウェルごとにカウントされるスポットの数を示します。赤い数字は、どのスポットがセルで、どのスポットが破片、アーティファクト、またはエッジ効果であるかを判断するために使用された参照ウェルを示し、解析から除外する必要があります。

Applications and Summary

ELISPOTアッセイは、特定の解体を分泌する細胞の数を決定することによって、免疫細胞の活性化を評価することを可能にする。スポットの大きさと強度は、各細胞によって生成される分析量に関する情報を提供します。上記のプロトコルは、単一のサイトカインの検出を詳細に説明した。しかし、最近の開発は、このアッセイの有用性を高めています。現在、ウェル内の複数の解素を検出するために蛍光検出染料を使用することができます。これにより、一方または両方の解体を分泌するセルの異なる亜集団の検出が可能です。

References

  1. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., & Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods, 65 (1), 109-121(1983).
  2. Wahid, R., Simon, J. K., Picking, W. L., Kotloff, K. L., Levine, M. M., & Sztein, M. B. Shigella antigen-specific B memory cells are associated with decreased disease severity in subjects challenged with wild-type Shigella flexneri 2a. Clinical Immunology, 148 (1), 35-43 (2013).
  3. Roberts, T. J., Lin, Y., Spence, P. M., Van Kaer, L., & Brutkiewicz, R. R. CD1d1-dependent control of the magnitude of an acute antiviral immune response. The Journal of Immunology, 172, 3454-3461 (2004).

1. セットアップ

バッファーと試薬

  1. カルシウムまたはマグネシウムを使用せずに生菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS)
  2. コーティングバッファー- 滅菌PBSまたは炭酸塩バッファーのいずれか
  3. PBSにおけるアッセイ希釈剤- 10%胎児ウシ血清(FBS)
  4. 細胞培養培地- 10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン、およびL-グルタミンを含むRPMI 1640
  5. 洗浄バッファー- 0.05% Tween20 を含む PBS
  6. 二重蒸留水(ddH2O)
  7. 検出基板-100mg AEC(3-アミノ-9-エチルカルバゾール)を10mL DMF(N,N,ジメチルホルミド)で検出した。

機器

  1. ラミナーフローフード
  2. 加湿インキュベーター(37°C、5%CO2に設定)
  3. 自動ELISPOTリーダーまたは解剖顕微鏡

材料

  1. エリスポットプレート
  2. 滅菌および非滅菌貯留所
  3. ピペッタとヒント
  4. 滅菌血清ピペット
  5. 滅菌、円錐状ポリプロピレンチューブ
  6. プレート洗浄用スクイーズボトル2本

アッセイ特異的試薬

  1. 細胞-一次細胞または細胞株(ここでは、C57BL/6マウス由来の脾細胞を用いた)
  2. 覚醒剤-ミトゲンまたは抗原(ここでは、ソルボル12-ミリステート13-アセテート(PMA、50ng/mL)およびイオノマイシン(1μM)を用いた。
  3. 一次抗体-ビオチン化抗サイトカイン検出抗体(アッセイ希釈剤で2μg/mLに希釈)
  4. 二次抗体- ストレプトアビジン-ワサビ性ペルオキシダーゼ(SAv-HRP)

2. 手続き

コーティング

  1. 条件を無菌および層状流フードの中に保ち、精製された抗サイトカイン捕捉抗体を無菌コーティングバッファー内の0.5-4.0 μg/mLの最終濃度に希釈する。(注:IFN-γおよびIL-6の場合は5 μg/mLを使用)。
  2. 捕捉抗体溶液100μL/ウェルをELISPOTプレートに移します。
  3. プレートカバーでプレートを覆い、蒸発を防ぐためにシールします。
  4. プレートを4°Cで一晩インキュベートします。

ブロック

  1. 翌日、層流フードにELISPOTプレートを発見。プレートを滅菌ワイプに素早く反転させ、各ウェルから捕捉抗体溶液を除去します。
  2. 次に、各ウェルに200μLの細胞培養培地を添加する。このステップは、アッセイ中に非特異的結合をブロックします。
  3. プレートカバーを交換し、37°Cで2時間インキュベートします。

めっきと細胞の活性化

  1. プレートがインキュベートされている間、細胞培養培地中に50ng/mL PMAおよび1μMイオノマイシンを含む2Xマイトゲン溶液を調出す。
  2. 次いで、標的細胞懸濁液を2x106細胞/mLのストック濃度に調出する。
  3. インキュベーションが完了したら、層流フード内の無菌ワイプにプレートを素早く反転させ、各ウェルから細胞培養培地を取り除きます。
  4. 次に、ストックセル懸濁液の2Xシリアル希釈を生成する。そうするには、まずELISPOTプレートの一番上の行のウェルに、準備された細胞懸濁液ストック溶液の200 μLを追加します。
  5. 次に、細胞ストック溶液を含む行の下のプレートの次の5行にプレーン細胞培地の100 μLを加える。
  6. その後、一番上の行から直下の行にセルラー懸濁液の100 μLをピペッティングして2Xシリアル希釈を行います。この溶液を上下にゆっくりとピペッティングして適切な混合を行い、セルの分配を均等にします。
  7. 残りの 4 行に対してこのプロセスを繰り返します。
  8. 6 行目はカルチャ メディアのみに残します。これは、実験的な制御として機能します。
  9. 次に、準備されたマイトゲン溶液の100 μLをプレートの最初の5列の実験井戸に加える。制御ウェルと6列目に、マイトゲンを含まない細胞培養培養培養剤の100μLを添加する。
  10. プレートカバーを交換し、プレートを37°C、5%CO2をインキュベーターで20~48時間交換します。(注:20~24時間は通常、IL-2およびTNF-αを検出するのに十分ですが、IL-4およびIFN-γには48時間が最適です。

検出

一次抗体

  1. アッセイ希釈剤中の2μg/mLの濃度に対する抗体を検出するバイオチン化抗サイトカインを調製する。
  2. PBSで0.05%のTween-20を混合することにより、この時点で洗浄バッファーの20〜25 mLを調製します。
  3. インキュベーションが完了したら、プレートのキャップを外し、シンクの上に素早く反転して、井戸からすべての液体を除去します。(注:この時点の後、プレートはもはや無菌状態に保つ必要はありません)。
  4. 次いで、各ウェルに〜200μL洗浄バッファーを加えてプレートを洗浄する。この液体を素早く反転させ、シンクの上にプレートをフリックして排出します。合計 5 回の洗い流しの場合は、このプロセスを繰り返します。
  5. 次に、希釈されたビオチン化抗サイトカイン検出抗体溶液を各ウェルに100μLを添加する。室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。

二次抗体

  1. インキュベーションが完了したら、シンク上のプレートを反転してフリックして検出抗体を排出します。
  2. 前と同様に、プレートを〜200μL洗浄バッファーで5回洗浄し、各洗浄の間に液体を排出する。
  3. 次に、希釈されたストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに100μL添加する(アッセイ希釈剤で予め決定された最適濃度に希釈)。
  4. プレートカバーを交換し、室温で37°Cで1.5~2時間インキュベートします。

基板

  1. インキュベーション後、使用の15分以内に、まずメーカーの指示に従ってAEC基板溶液を活性化する。
  2. 次に、井戸の中身を捨て、以前と同様に洗浄バッファーでプレートを5回洗浄します。
  3. 次に、直ちに各ウェルに100μLのAEC基板溶液を添加する。
  4. スポットの発達を監視しながら、室温でプレートを10~20分間インキュベートします。
  5. プレートを水ですすいで、流しの上でプレートをフリックして反応を止めます。
  6. ペーパータオルにプレートをブロットし、プレートが一晩または完全に乾燥するまで乾燥させます。プレートの下のプラスチックトレイを取り外すと、乾燥が容易になります。

3. データ取得・分析

  1. 乾燥後、スポットは自動プレートリーダーでカウントする準備ができています。ここでは、CTL免疫スポットリーダーが使用されるが、このプロトコルは、任意のリーダーに適合させることができる。
  2. まず楽器の電源を入れ、次にコンピュータの電源を入れます。次に、CTLプログラムを開き、「スキャンカウント」をクリックします。
  3. トレイを「イジェクト」押してマシンから伸ばします。次に、プラスチック製のアダプターを取り外し、ELISPOTプレートとアダプターの行「A」を揃えます。
  4. 保存するファイル名と場所を選択し、プレートをトレイにロードします。
  5. 次に、ソフトウェアの「ロード」をクリックし、マシンの側面にあるドアを閉じます。
  6. 「カウント後開始」を押します。ファイルが保存されていることを確認し、品質管理「QC」ソフトウェアを開いてデータを分析し、スポット数をカウントします。

ノート:

  1. 細胞の最小数は、予備実験で決定する必要があります。最適なスポット数は~50/ウェルです。読み込まれるセルが多すぎると、個別のスポットを検出するのが難しくなります。さらに、細胞は重なり合い、膜上に単層を形成しない可能性があるため、検出のレベルが低下する可能性があります。
  2. 実験を最適化する際には、標的タンパク質の期待発現レベルを考慮する。発現が低いほど、ウェルあたりに必要なセル数が多くなります。
  3. ELISAとは異なり、プレートウォッシャーを使用するよりも、プレートを手洗いする方が良いです。ELISPOTプレートはより繊細であり、PVDF膜の穿刺を避ける必要があります。
  4. スポットが汚れる可能性があるため、インキュベーション期間中のプレートの動きを制限する必要があります。
  5. 直接光にさらされるとスポットがフェードするので、プレートは暗闇の中に保管する必要があります。

酵素結合免疫スポット、またはELISPOTアッセイは、病原体または細胞損傷に対する免疫応答を分析する方法である。それは彼らが分泌する特定のタンパク質を検出することによって異なる免疫細胞の活性化の定量化を可能にする。例えば、ELISPOTは、分泌されたサイトカインを検出することにより、外来抗原に曝露した際のT細胞応答を測定するために一般的に使用される。

サイトカインベースのELISPOTアッセイの場合、プロセスは標的サイトカインに特異的である捕捉抗体を用いたELISPOTマイクロプレートのコーティングから始まります。抗体コーティング後、T細胞をウェルに添加し、例えば抗CD3抗体のような外部薬剤によって刺激される。細胞は、その後、捕捉抗体によって直ちに固定化される標的サイトカインを分泌する。タンパク質は生細胞からの分泌後即座に捕捉されるので、希釈や分解を行うことなく、このアッセイは高精度です。標的サイトカインが固定化されると、検出抗体が追加され、捕捉されたサイトカインにも結合する。

ELISPOT技術は、特定の抗体の産生を分析することにより、感染またはワクチン接種後の記憶B細胞を定量化するためにも使用することができる。抗体ベースのELISPOTでは、抗体の代わりに特定の抗原が使用され、抗原がプレートに結合するか、検出ステップで抗原が標的抗体ポストキャプチャを検出します。プロセスのすべてのバリエーションにおいて、T細胞またはB細胞に対して、検出抗体または抗原はビオチン化され、ワサビペペキシダーゼなどのストレプトアビジン結合検出酵素に結合することを可能にする。そして、ペルオキシダーゼの基質を添加すると、AEC、暗く、不溶性の沈殿物が生成される。この沈殿物は、捕捉されたタンパク質の位置をマークし、各分泌細胞は、ELISPOTリーダーまたは顕微鏡を使用して定量することができる目に見えるスポットをもたらします。スポットの大きさは、各細胞から分泌されるタンパク質の量の相対的な推定値です。このアッセイは、分泌細胞の比較的小さな亜集団においても、単一細胞からの免疫応答を検出することができ、細胞レベルでの免疫応答の研究に有用である。

このビデオでは、ELISPOT アッセイを実行し、分泌細胞を表すスポットを定量する方法を学習します。

実験を通して、層流フードで働き、手袋を着用することによって無菌状態を保障する。

このプロトコルのすべての計算は、1つの96ウェルプレートに必要なボリュームに基づいています。

まず、抗サイトカイン捕捉抗体を希釈する。これを行うには、無菌の15ミリリットルの円錐形チューブにバッファの10ミリリットルを転送します。次に、ピペットを使用してモノクローナル抗体1ミリリットル当たり10マイクロリットルをバッファーに追加し、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度の溶液を作成します。次に、捕捉抗体溶液を無菌貯留槽に注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルELISPOTプレートの各ウェルに100マイクロリットルを分配する。

プレートカバーでプレートを覆い、蒸発を防ぐためにシールし、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、層流フードにELISPOTプレートを発見。プレートを滅菌ワイプに素早く反転させ、各ウェルから捕捉抗体溶液を除去します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに200マイクロリットルの細胞培養培地を追加します。このステップは、アッセイ中に非特異的結合をブロックします。プレートカバーを交換し、37°Cのインキュベーターで2時間インキュベートします。

プレートがインキュベートされている間、1マイクロリットルのPMAと20マイクロリットルのイオノマイシンを10ミリリットルの細胞培養培地に加えて2倍のマイトゲン溶液を調製し、1ミリリットルPMAあたり15ナノグラムの最終濃度と1マイクロモルイオノマイシンを達成する。

マウス脾細胞の細胞懸濁液も滅菌フードでこの時点で調製する必要があります。顕微鏡と血球計を用いて細胞の濃度を測定し、1ミリリットル当たり200万個の細胞のストック濃度に達するまで総体積を調整する。

インキュベーションが完了したら、プレートを無菌ワイプに素早く反転させ、各ウェルから細胞培養培地を除去する。次に、ELISPOTプレートの一番上の行のウェルに、準備されたセルラー懸濁液ストック溶液の200マイクロリットルを追加します。テストを三つ三つ三つ三つに設定し、テストした各セルタイプが3つのグループ化された列のセットにメッキされます。この下に、100マイクロリットルのプレーン細胞培地をプレートの次の5列に加え、細胞ストック溶液を含む行の下に加える。

次に、セル懸濁液の100マイクロリットルを一番上の行から真下の行にピペッティングし、溶液を上下に優しく配管して細胞を均等に分配することによってシリアル希釈を行う。残りの行に対してこのプロセスを繰り返し、前の行から各ステップの下の行に 100 マイクロリットルを移動し、5 行目が連続的に希釈されるまで続けます。6列目を細胞培養培地のみで残し、コントロールとして機能させる。プレートの実験井戸内の細胞を刺激するために、準備されたマイトゲン溶液の100マイクロリットルを行1〜5の各ウェルの細胞懸濁液に加える。コントロールとして機能する6行目を刺激しないで残してください。蓋を交換し、プレートを摂氏37度、CO25%で24~48時間インキュベートします。

希釈されたビオチン化抗サイトカイン検出抗体を調製する。まず、PBSの45ミリリットルに10%のウシ血清の5ミリリットルを添加することにより、希釈アッセイの50ミリリットルを調製する。次に、検出抗体をアッセイ希釈剤で1ミリリットル当たり2マイクログラムの濃度に希釈する。また、このとき洗浄バッファーの20〜25ミリリットルを調製し、.05%のTween-20とPBSを混合して調製する。

インキュベーションが完了したら、プレートのキャップを外し、すぐに反転して井戸からすべての液体を除去します。各井戸に約200マイクロリットルの洗浄バッファーを追加してプレートを洗浄します。この液体を素早く反転させ、シンクの上にプレートをフリックして排出します。このプロセスをさらに 4 回繰り返し、合計 5 回の洗い流しを行います。次に、希釈検出抗体溶液の100マイクロリットルを各ウェルに加え、蓋を交換し、室温で2時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートをシンク上に反転してフリックすることにより、プレートのウェルから検出抗体溶液を排出する。

前と同様に、洗浄バッファーでプレートを5回洗浄し、各洗浄の間に液体を排出する。最終洗浄後、製造元の指示に従って希釈してストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼ溶液を調製する。次に、プレートの井戸を空にして、希釈されたストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに100マイクロリットルを加える。蓋をプレートに戻し、室温で2時間インキュベートします。

インキュベーション後、使用の15分以内に、あらかじめ作られたAEC基板溶液を活性化する。井戸の中身を捨て、以前と同様に洗浄バッファーで5回洗浄します。次に、直ちに各ウェルに100マイクロリットルのAEC基板溶液を添加する。プレートを室温のままにし、スポットの発達を監視しながら約10~20分間開発します。これらのスポットは、井戸の表面に小さく暗い円として表示されます。その後、水でプレートをすすいで、シンクの上にそれをフリックすることによって、反応を停止します。ペーパータオルの上にプレートをブロットし、一晩または完全に乾燥するまで空気乾燥を可能にします。プレートの下のプラスチックトレイを取り外すと、乾燥が容易になります。乾燥後、スポットは自動プレートリーダーでカウントする準備ができています。

ここでは、CTL ImmunoSpotリーダーが使用されますが、このプロトコルは任意のリーダーに適合させることができます。次に、CTLプログラムを開き、スキャンカウントをクリックします。トレイのイジェクトを押して、マシンから伸ばします。次に、プラスチック製のアダプターを取り外し、ELISPOT プレートとアダプターの行 A を揃えます。ファイルを保存するファイル名と場所を選択し、プレートとアダプタをトレイにロードします。ソフトウェアのロードをクリックし、マシンの側面にあるドアを閉じます。次に、[カウント後に開始] を押します。ファイルが保存されていることを確認し、品質管理QCソフトウェアを開いてデータを分析し、スポットの数をカウントします。このデータを Excel ファイルとしてエクスポートします。解析が完了したら、[射出] をクリックしてプレートを取得します。

この実験では、野生型および腫瘍を有するマウスの細胞をめっきし、IFNガンマについて分析した。細胞濃度が低下するとスポット数が減少します。通常、ELISPOTデータは、めっきされたセル数あたりのスポット数として表示されます。この例では、スポットの数を棒グラフに表示し、それぞれの細胞濃度を X 軸に一覧表示しました。スポットの数は、特定の母集団内のセルの合計数あたりのアクティブ化されたセルの数を示していることに注意してください。

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