Inmunohistoquímica e Inmunocitoquímica: Imágenes de tejidos a través de microscopía de luz

Immunology

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Concepts

Fuente: Michael S. Lee1 y Tonya J. Webb1
1 Departamento de Microbiología e Inmunología, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland y el Centro Integral del Cáncer Marlene y Stewart Greenebaum, Baltimore, Maryland 21201

La inmunohistoquímica (IHC) y la inmunocitoquímica (ICC) son técnicas utilizadas para visualizar la expresión y localización de antígenos específicos utilizando anticuerpos. El primer uso publicado de IHC fue en 1941 cuando Albert Coons utilizó la técnica para visualizar la presencia de antígeno neumocócico en secciones de tejido de ratones infectados con Pneumococcus (1). El nombre, inmunohistoquímica, se deriva de las raíces "inmuno-", en referencia a los anticuerpos, y "histo-", en referencia a las secciones de tejido utilizadas en IHC. La raíz "cito-" en inmunocitoquímica destaca la diferencia clave entre ICC e IHC. Mientras que IHC utiliza secciones de tejido entero, ICC utiliza células que han sido aisladas de tejido o cultivadas en cultivo. La diferencia en las muestras utilizadas significa que la preparación de muestras difiere técnicamente entre iHC y la CPI, pero de lo contrario los protocolos para ICC e IHC son idénticos y uno encontrará que los términos se utilizan con frecuencia indistintamente.

Tanto en IHC como en ICC, los anticuerpos con etiquetas químicas o fluorescentes, como la peroxidasa o la rodamina, respectivamente, se utilizan para visualizar la distribución de cualquier antígeno de interés a través de la unión específica del anticuerpo etiquetado al antígeno. En el caso de IHC, las rodajas finas de tejido se inmovilizan en una diapositiva para mantener la estructura del tejido antes de ser manchado, permitiendo la visualización de antígenos en el contexto de tejidos enteros (Figura 1). En el caso de la CPI, las células se distribuyen uniformemente en una diapositiva antes de ser teñidas, permitiendo la visualización de la distribución de antígenos dentro de las células individuales, pero no dentro de la estructura de cualquier tejido específico. Debido a las similitudes entre los dos protocolos, este protocolo se centrará en iHC para abordar las complejidades adicionales de la preparación de muestras involucradas en el IHC.

Figure 1
Figura 1: Esquema del Protocolo IHC. Esquema visual de un protocolo IHC para tejido incrustado en parafina diseccionado desde un ratón. Este protocolo utiliza un anticuerpo secundario biotinilado y estrepavidina-HRP para visualizar la ubicación de la unión de anticuerpos. Otras opciones, como los anticuerpos etiquetados fluorescentemente, también son posibles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La primera decisión importante al realizar IHC es cómo preparar las secciones de tejido con el fin de mantener la estructura del tejido durante todo el proceso de tinción. Las dos opciones principales son secciones fijas de formalina de tejido incrustado en parafina o secciones frescas de tejido congelado. No hay una respuesta simple sobre qué método utilizar, ya que depende de qué análisis posterior se llevará a cabo. La formalina-fijación de los tejidos incrustados de parafina generalmente se piensa para preservar mejor la morfología del tejido para obtener imágenes óptimas, mientras que la congelación de tejido fresco puede preservar la función proteica para ensayos posteriores fuera de IHC. Además, se ha demostrado que las secciones de tejido congelado fresco son más adecuadas para el análisis de la expresión génica (2). Una tercera consideración es si los anticuerpos para su antígeno de interés son adecuados para secciones de tejido fijo o congelado, ya que algunos anticuerpos solo se han optimizado para un tipo específico de sección y pueden no funcionar para otros. Por último, también hay que determinar cuánto tiempo necesitan para almacenar las secciones de tejido, ya que las muestras congeladas frescas deben mantenerse a -80 oC y no pueden durar más de un año, mientras que las secciones fijas se pueden almacenar durante mucho más tiempo a temperatura ambiente. Estas son algunas de las principales consideraciones para determinar si se deben utilizar secciones fijas de formalina de tejido incrustado en parafina o secciones frescas de tejido congelado. En última instancia, si uno tiene suficiente tejido, puede ser mejor sólo tener algunos de ambos.

En este experimento, nos propusimos determinar si la expresión de ciclina D1 se incrementó en el bazo agrandado a partir de un modelo espontáneo de ratón de desarrollo de linfoma. Las muestras de tejido esplénico se aislaron primero de ratones de tipo salvaje, ratones transgénicos que no tienen linfoma o ratones transgénicos que tienen linfoma desarrollado espontáneamente. Las muestras de tejido del bazo se fijaron en paraformaldehído, incrustadas en parafina, seccionadas, teñidas con un anticuerpo primario anticiclina D1 de ratón seguido de un anticuerpo secundario anti-ratón de caballo, y desarrolladas con 3,3-diaminobenzidina (DAB). Las secciones fueron contrarrestadas en Harris Hematoxylin Solution y luego las secciones fueron imágenes con aumento 20X.

Reactivos

Secciones integradas en Parafina

  1. 4% Paraformaldehyde (PFA)
  2. Etanol (anhidro desnaturalizado, grado histológico 100%, 95%, 80%, 75% y 50%). Se puede diluir a partir de 100% de stock utilizando agua destilada doble (ddH2O)
  3. Xileno
  4. Diapositiva de vidrio compatible con IHC para asegurar que la sección de tejido permanezca unida durante todo el procedimiento. Las guías de vidrio compatibles con IHC tienen un recubrimiento especializado y están disponibles en varios minoristas. Si realiza ICC, utilice una diapositiva con cámara. Las diapositivas acotadas permiten que las células se salpiquen en las cámaras y se coloquen en la incubadora hasta que las células se adhieran a la diapositiva y alcancen la confluencia adecuada, momento en el que las cámaras se pueden retirar y la tinción puede continuar de la misma manera que IHC.
  5. Parafina
  6. 0.3% Peróxido de hidrógeno (H2O2)/metanol: Para preparar, añadir 1 mL 30% H2O 2 O2 a 99 mL de metanol. Conservar a -20oC
  7. Tampón de recuperación de antígenos: tampón de citrato IHC pH 6.0

Secciones Frescas Congeladas

  1. Compuesto de incrustación de temperatura de corte óptima (OCT)
  2. Fijador óptimo: 4% PFA o acetona que se ha enfriado a -20 oC

Tinción

  1. Búfer de bloqueo: debe ser determinado por el usuario. Un ejemplo es el suero de caballo diluido en 1X PBS
  2. Anticuerpo primario diluido: ver las especificaciones del fabricante
  3. Anticuerpo secundario biotinylato diluido: ver las especificaciones del fabricante
  4. Peroxidasa de ávidina-caballo diluida (HRP): Sólo para la visualización de peroxidasa. Consulte las especificaciones del fabricante.
  5. DAB u otro sustrato compatible
  6. Contramancha (opcional)
  7. Etanol (anhidro desnaturalizado, grado histológico 100% y 95%)
  8. Xileno
  9. Montaje Organo/Limoneno

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Inmunología. Inmunohistoquímica e Inmunocitoquímica: Imágenes de tejidos a través de microscopía de luz. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. Preparación de células para la inmunocitoquímica

  1. Células de semilla de interés sobre diapositivas con cámara o cubredes con cámara añadiendo 0,5 ml de suspensión celular a los pozos de una placa de cultivo de 24 pozos.
    Nota: Algunas células pueden requerir crecimiento en los labios de cubiertatratada, como los cubreobjetos tratados con polilisina. Las condiciones óptimas de tratamiento deben ser determinadas por el usuario dependiendo del tipo de célula que se esté utilizando.
  2. Coloque la placa en una incubadora de CO2 humidificada y permita que las células crezcan a 37oC hasta un 50-70% de confluente.
  3. Una vez que las células alcancen una confluencia óptima, retire los medios de cultivo de cada poca y luego, fije las células incubando en 0,5 ml de 4% de PFA (diluido en 1X PBS) e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
  4. Retire el fijador y lave los pozos tres veces con 1 ml de 1X PBS.
  5. A continuación, permeabilizar las células agregando 0.5 mL de 0.1% Triton-X-100 en 1X PBS a cada pozo e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
  6. Aspirar fuera del tampón de permeabilización y lavar los pozos tres veces con 1 mL de 1X PBS.
  7. Las células en los labios de cubierta ahora están fijas y permeabilizadas. Proceda al procedimiento de tinción demostrado para el siguiente ejemplo de inmunohistoquímica, con la excepción de que las incubaciones deben realizarse dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos en lugar de directamente en un portaobjetos de sección de tejido.

2. Preparación de secciones de formalina fija, incrustadas en parafina para la tinción

  1. Obtenga secciones de tejido sinua inadtemis preparadas y fijas en la formalina.

Desparaffinización

  1. Sumerja las diapositivas en 100% xileno 2 veces durante 5 min cada una.

Rehidratación

  1. Sumerja las diapositivas en etanol 100% 2 veces durante 3 min cada una.
  2. Sumerja las diapositivas en etanol al 95% durante 3 min.
  3. Sumerja las diapositivas en 70% de etanol durante 3 min.
  4. Sumerja las diapositivas en 50% de etanol durante 3 min.

Bloqueo de la actividad endógena de la peroxidasa

  1. Incubar los portaobjetos en 100 ml de 0,3% H2O2 durante 30 min a temperatura ambiente.
  2. Lave los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada uno.

Recuperación de antígenos

  1. Sumerja las diapositivas en el tampón de citrato IHC (pH 6) y herértelas durante 20 minutos.
  2. Las diapositivas de tejido ya están listas para la tinción.

3. Preparación de secciones de inmovilización fresca, OTC para la tinción

  1. Coloque 5 mm de tejido aislado fresco en un molde y agregue OCT hasta que la sección esté completamente cubierta.
  2. Sumerja lentamente el bloque de tejido en nitrógeno líquido hasta que se congele por completo. La muestra ahora se puede almacenar a -80 oC durante un máximo de 1 año.
  3. Una vez listo para el seccionamiento, transfiera el bloque de tejido congelado a un criostato y permita que toda la configuración llegue a -20 oC.
  4. Corte secciones de tejido grueso de 5-10 m con un criostato y use un cepillo para colocar secciones directamente en diapositivas de vidrio compatibles con IHC.
  5. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche a temperatura ambiente. Las diapositivas también se pueden almacenar a -80 oC.
  6. Sumerja los portaobjetos en 250 ml de 4% de PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente para fijar los portaobjetos antes de la tinción. El método de fijación óptimo debe ser determinado por el usuario.
  7. Sumerja las diapositivas en 250 ml de 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.
  8. Sumerja los portaobjetos en 250 ml de 0,3% H2O2 para 30 min a temperatura ambiente para bloquear cualquier actividad endógena de peroxidasa.
  9. Sumerja las diapositivas en 250 ml de 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.
  10. Las diapositivas ya están listas para la tinción.

4. Tinción

  1. Círculo del tejido con una barrera hidrófoba usando una pluma de barrera.

Bloqueo

  1. Usando una pipeta, coloque 100 l de tampón de bloqueo (suero de caballo diluido en 1X PBS) - sobre la sección durante 1 hora a temperatura ambiente.
  2. Retire el tampón de bloqueo con una pipeta.

Incubación de anticuerpos primarios

  1. Incubar el tejido rodeado con una solución de anticuerpos primarios diluido de 100 l (ciclina antihumana de ratón D1 diluida 1:100 en tampón de bloqueo) durante 30 min a temperatura ambiente.
  2. Escurrir el anticuerpo primario de cada portaobjetos y lavar los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 minutos cada uno.

Incubación Secundaria de Anticuerpos

  1. Incubar la muestra con 100 ml de anticuerpo secundario biotinilado diluido (IgG antiratón de caballo biotinilado diluido 1:200) durante 30 min a temperatura ambiente.
  2. Retire el anticuerpo secundario drenando las secciones y lávelo con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.

Desarrollo del color

  1. Visualización mediante HRP: Añadir 100 ml de reactivo complejo de avidina-biotina (ABC) e incubar las secciones en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente
    Nota: Los anticuerpos con etiquetas fluorescentes también se pueden utilizar y visualizar con un microscopio adecuado.
  2. Lave los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada uno.
  3. Desarrollar las diapositivas incubando las secciones en 100 s de DAB durante un máximo de 5 min.
  4. Detenga el desarrollo añadiendo agua destilada (dH2O) durante 5 min a temperatura ambiente.

Contramanchación (si se desea)

  1. Sumerja las diapositivas brevemente en Harris Hematoxylin Solution (o 0.5% de verde metilo en 0.1M de acetato de sodio (pH 4.2)) durante 10 min.
  2. Enjuague la contramancha lavando los portaobjetos en dH2O dos veces durante 5 min cada uno.

Deshidratación

  1. Sumerja las diapositivas en etanol al 95% 2 veces durante 5 min cada una.
  2. Sumerja las diapositivas en etanol 100% 2 veces durante 5 min cada una.
  3. Sumerja las diapositivas en 100% xileno 2 veces durante 5 min cada una.
  4. Sopla reline las diapositivas con una toalla de papel.

Aplicación de montaje y cubreobjetos

  1. Agregue una gota de soporte de montaje como Organo-Limoneene Mount a las diapositivas y coloque una tapa sobre las secciones.

Análisis microscópico

  1. Observe las secciones manchadas bajo un microscopio apropiado para el análisis. Aquí se utilizó un microscopio de luz estándar para la observación y se utilizó una cámara digital montada para la toma de imágenes.

La inmunocitoquímica y la inmunohistoquímica son métodos de tinción para una proteína de interés en las células y tejidos cultivados, respectivamente. El principio básico de ambas técnicas relacionadas implica el uso de anticuerpos específicos etiquetados con un sistema de detección para identificar y visualizar la proteína y determinar su ubicación dentro de las células y tejidos, así como los niveles relativos. El proceso en cualquiera de los experimentos comienza con la preparación de la muestra.

Para la inmunocitoquímica, que visualiza específicamente las ubicaciones de proteínas o antígenos en las células, esto implica tres pasos. El primer paso es el revestimiento, que implica el cultivo de las células en medios de crecimiento en un resbalón de cubierta o diapositiva, por lo general, en los pozos de una placa de cultivo. Esto es seguido por la fijación, donde un agente precipitante o reticulante como paraformaldehído se agrega a las células para preservar la integridad estructural de las proteínas y evitar que la actividad enzimática las degrade. El último paso es la permeabilización, que implica la adición de un detergente para hacer que las membranas celulares sean permeables para la tinción.

En el método homólogo, la inmunohistoquímica, las proteínas o los antígenos se visualizan en los tejidos y la preparación de la muestra tiene cinco pasos. En primer lugar, todo el tejido se somete a fijación, generalmente con paraformaldehído. Esto es seguido por la incrustación del tejido en un bloque de parafina, y luego la sección de este bloque usando una máquina llamada microtome para cortar el tejido en rodajas delgadas que se pueden colocar en diapositivas. A continuación, las diapositivas se someten a desparafinación, o eliminación de la parafina alrededor de la rebanada de tejido. A continuación, se puede realizar un paso opcional de recuperación de antígenos. Esto se puede hacer usando calor o enzimas para desenmascarar epítopos que fueron reticulados durante la fijación, haciéndolos disponibles para la unión de anticuerpos. Después de la preparación adecuada de la muestra, se agrega un anticuerpo primario específico del objetivo a la muestra de células o tejidos. Este anticuerpo primario debe unirse a la proteína de interés. A continuación, se añade un anticuerpo secundario, que detecta y se une al anticuerpo primario. Este anticuerpo secundario se conjuga con una enzima llamada HRP o puede unirse a ella. Cuando se añade su sustrato específico, DAB, HRP lo convierte en un precipitado marrón insoluble. Esta mancha marrón marca la ubicación de la proteína diana. Las diapositivas también están teñidas con hematoxilina, que etiqueta los núcleos en azul y proporciona un punto de referencia espacial para determinar la localización subcelular. Después de eso, el soporte de montaje se añade a la diapositiva, seguido de un deslizamiento de la cubierta con el fin de sellar y preservar la muestra manchada. Por último, las diapositivas se pueden crear imágenes en un microscopio de luz.

En este video, observará la técnica de preparación de muestras para células chapadas y secciones de tejido, seguida de inmunomanchación de las secciones de tejido.

En primer lugar, las células de interés deben sentarse en los labios de las cubiertas. Para ello, trabajando en una capucha de cultivo de tejido, coloque los cubredes individuales en los pozos de una placa de 24 pocillos. A continuación, cierre la faja y encienda la luz UV para esterilizar los labios de las cubiertas durante al menos 15 minutos. A continuación, apague la luz UV. Para levantar las células de interés de un plato de 10 centímetros confluente, aspirar el medio, lavar brevemente con PBS y agregar trippsina a las células durante 2 minutos. A continuación, toque el lado de la placa para asegurarse de que las células se han desprendido y neutralizar la trippsina con medios. A continuación, agregue 0. 5 ml de la suspensión celular en cada poca, asegurándose de cubrir los cubrecubiertas. Coloque la placa en una incubadora de CO2 humidificada y permita que las células crezcan a 37 grados centígrados hasta que sean de 50-70% de confluentes.

Una vez que las células alcanzan la confluencia óptima, aspirar el medio de cultivo de cada poca, y luego fijar las células incubando en . 5 ml de paraformaldehído 4% diluido en 1X PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el fijador, enjuague las células añadiendo 1 ml de 1X PBS sobre cada cubreobjetos. Aspirar inmediatamente el PBS, luego repetir el enjuague 2 veces más para un total de 3 lavados.

Ahora, permeablize las celdas agregando 0.5 mL de 0.1% Triton X-100 en 1X PBS a cada pozo. Deje el plato a temperatura ambiente durante 15 minutos. Aspirar fuera del búfer de permeabilización y luego enjuagar las células agregando 1 mL de 1X PBS en cada pozo. Aspirar inmediatamente el PBS y repetir el enjuague 2 veces más para un total de 3 lavados. Ahora que las células en los cubreobjetos están fijas y permeabilizadas, proceda al procedimiento de tinción demostrado para el siguiente ejemplo de inmunohistoquímica con la excepción de que las incubaciones deben realizarse dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos en lugar de directamente en una diapositiva de sección de tejido.

Para empezar, obtener secciones de tejido preparadas, fijas en formalina, incrustadas en parafina. Desparaffinizar las diapositivas colocándolas en un portaobjetos y luego sumergirlas por completo en 250 ml de 100% de xileno. Deje que las diapositivas se incuban durante 5 minutos en el xileno. A continuación, retire los portaobjetos del recipiente, límpielos con una toalla de papel y colóquelos en un nuevo baño de xileno en un recipiente nuevo durante otros 5 minutos.

A continuación, rehidrata las secciones de una serie de soluciones de etanol calificadas a partir del 100% de etanol durante 3 minutos. Limpie la portaobjetos con una toalla de papel y transfiera las diapositivas a un nuevo recipiente de etanol 100% durante otros 3 minutos. Continúe este ciclo de lavado, secado con una toalla de papel y transferencia de los portaobjetos a un nuevo baño siguiendo las concentraciones indicadas de etanol durante el tiempo especificado. Después del lavado final de etanol, limpie el estante con una toalla de papel e incubar los portaobjetos en 100 ml de peróxido de hidrógeno de .3% durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear cualquier actividad endógena de peroxidasa. Lave los portaobjetos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado en un recipiente de 1X PBS fresco durante 5 minutos adicionales.

A continuación, realice la recuperación de antígenos sumergiendo las diapositivas en 250 ml del tampón de citrato IHC a pH 6.0 y hirviéndolas durante 20 minutos. Luego, proceda al protocolo de tinción.

Para comenzar el proceso de tinción para IHC, circule las secciones con una pluma hidrófoba para identificar el área mínima que el tampón necesita cubrir. A continuación, utilice una pipeta para colocar 100 microlitros de tampón de bloqueo, que en este experimento es suero de caballo diluido en 1X PBS, sobre la sección. Incubar los toboganes durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de esto, retire el búfer de bloqueo utilizando una pipeta.

A continuación, diluir el anticuerpo primario y el tampón de bloqueo en una dilución de 1:100 mediante la adición de 990 microlitros de suero de caballo diluido en 1X PBS en un 1. Tubo Eppendorf de 5 ml, seguido de 10 microlitros del anticuerpo primario. Añadir 100 microlitros del anticuerpo primario diluido a cada sección, e incubar los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando suene el temporizador, drene el anticuerpo primario de cada diapositiva y luego lávelo en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado una vez más usando 1X PBS fresco.

Mientras que los portaobjetos se lavan en 1X PBS, diluir el anticuerpo secundario a una dilución 1:200 mediante la adición de 995 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de 1,5 ml seguido de 5 microlitros del anticuerpo secundario, que en este caso es biotinylated caballo anti-ratón IGG. Añadir 100 microlitros del anticuerpo secundario diluido a cada sección, y luego incubar los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, retire el anticuerpo secundario drenando las secciones, luego lave los portaobjetos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado con 1X PBS fresco.

Ahora, agregue 100 microlitros de reactivo complejo de avidina-biotina e incubar las secciones en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos sumergiéndolos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Al igual que los pasos de lavado anteriores, repita este lavado una vez más con el PBS 1X fresco. A continuación, desarrollar las diapositivas mediante la incubación de las secciones en 100 microlitros de DAB durante un máximo de 5 minutos. Detenga el desarrollo sumergiendo las secciones en 250 ml de agua destilada durante 5 minutos.

Ahora, las diapositivas se pueden contraconservar, si se desea. Para ello, sumerja brevemente los portaobjetos en 250 ml de Harris Hematoxylin Solution. Enjuagar la contramancha lavando los portaobjetos en 250 ml de agua destilada durante 5 minutos. Repita este lavado 1 vez más con agua fresca destilada. A continuación, deshidratar las secciones. Para ello, primero incubar los toboganes en etanol al 95% durante 5 minutos. Soplar los portaobjetos en una toalla de papel, y transferirlos a un nuevo recipiente de etanol fresco 95% durante otros 5 minutos. Continúe el ciclo de lavado, hinchando con una toalla de papel y transfiriendo los portaobjetos a un baño nuevo, siguiendo las soluciones indicadas durante 5 minutos cada uno.

Después de la incubación final, separen las diapositivas con una toalla de papel y, a continuación, agregue una gota de soporte de montaje, como el monte Organo-Limoneno, a las diapositivas. Ahora, coloque un cubreobjetos sobre las secciones, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire. Las diapositivas ya están listas para ser observadas bajo un microscopio para su análisis.

Para observar las secciones manchadas, utilice un microscopio de luz estándar para visualizar la mancha y una cámara digital para capturar la imagen. En este ejemplo particular de IHC, los tejidos del bazo de tipo salvaje y espontáneos, dobletransgénicos o ratones DTG, se comparan para estudiar la expresión de Dyclin D1 en el linfoma. Los tejidos estaban incrustados en parafina, seccionados y teñidos con anticuerpo anticiclina D1, y se imagearon con aumento 20 veces. Las células expresións de la ciclina D1 están indicadas por el color marrón rojizo sobre el fondo del tejido azul. Comparando las intensidades de tinción entre las imágenes de los diversos ratones, los bazos no agrandados tienen cantidades relativamente bajas de expresión de Cyclin D1 independientemente del genotipo del ratón. Por el contrario, el bazo agrandado del ratón DTG, muestra un aumento de la tinción de color marrón rojizo que indica una correlación entre el desarrollo del cáncer y la expresión de Ciclina D1 en este modelo de ratón.

Results

IHC e ICC tienen una amplia gama de aplicaciones. Por ejemplo, un uso de IHC es examinar la expresión de oncogenes en modelos espontáneos de ratón de desarrollo tumoral. En la Figura 2, nos propusimos determinar si la expresión de ciclina D1 se incrementó en el bazo agrandado en un modelo espontáneo de ratón de desarrollo de linfoma. Las muestras de tejido esplénico se fijaron en paraformaldehído, incrustadas en parafina, seccionadas, teñidas utilizando un anticuerpo anticiclina D1 (diluido 1:200 en tampón de bloqueo), y luego las secciones se crearon como imagen con un aumento de 20x. Las células expresións de la ciclina D1 están indicadas por el color marrón rojizo sobre el fondo del tejido azul. Estos resultados sugieren que la expresión de la ciclina D1 se incrementó en el bazo agrandado, lo que indica una correlación entre el desarrollo del cáncer y la expresión de la ciclina D1 en este modelo.

Figure 2
Figura 2: Expresión de ciclina esplénica D1 en un modelo de ratón doble transgénico espontáneo (DTG) de linfoma. Una imagen de tejido esplénico manchado con un anticuerpo primario anti-Ciclina D1, contrarestado con verde metilo, y visualizado utilizando un anticuerpo secundario biotinilado y un reactivo ABC activado con sustrato DAB. El color marrón rojizo representa lugares donde el anticuerpo ha encualado indicando la presencia de Cyclin D1 expresando células tumorales dentro de la estructura del tejido esplénico que ha sido contramanchado azul. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Applications and Summary

La inmunohistoquímica (IHC) y la inmunocitoquímica (ICC) son técnicas utilizadas para visualizar la expresión y localización de antígenos específicos utilizando anticuerpos. Los tejidos se cortan primero en secciones delgadas que mantienen la morfología del tejido y se colocan en una diapositiva. A continuación, se añaden los anticuerpos que unen el antígeno de interés y están equipados con una etiqueta específica que les permite visualizarse bajo un microscopio. Así, a través de este concepto básico, se puede visualizar y estudiar la distribución de antígenos en el contexto de la estructura tisular. Sin embargo, si bien el concepto general es básico, hay múltiples enfoques y variaciones diferentes que se han desarrollado que aumentan tanto la complejidad como la utilidad de estas técnicas. Este documento ha abarcado el concepto básico de IHC y icc, las principales decisiones que deben tenerse en cuenta al utilizar estas técnicas, y un protocolo detallado paso a paso. Las imágenes producidas por IHC e ICC son generalmente el producto final y pueden publicarse como lo es para resaltar diferencias obvias en cantidades o distribución de tinción entre diferentes condiciones.

References

  1. Coons, A. H. Creech, H. J., Jones, N. and Berliner, E. The Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of Fluorescent Antibody, The Journal of Immunology, 45 (3), 159-170 (1942).
  2. Ripoli, F. L., Mohr, A., Hammer, S. C., Willenbrock, S., Hewicker-Trautwein, M., Hennecke, S., Escobar, H. M. and Nolte, I. A comparison of fresh frozen vs. Formalin-fixed, paraffin-embedded specimens of canine mammary tumors via branched-DNA assay. International Journal of Molecular Sciences, 17 (5) (2016).

1. Preparación de células para la inmunocitoquímica

  1. Células de semilla de interés sobre diapositivas con cámara o cubredes con cámara añadiendo 0,5 ml de suspensión celular a los pozos de una placa de cultivo de 24 pozos.
    Nota: Algunas células pueden requerir crecimiento en los labios de cubiertatratada, como los cubreobjetos tratados con polilisina. Las condiciones óptimas de tratamiento deben ser determinadas por el usuario dependiendo del tipo de célula que se esté utilizando.
  2. Coloque la placa en una incubadora de CO2 humidificada y permita que las células crezcan a 37oC hasta un 50-70% de confluente.
  3. Una vez que las células alcancen una confluencia óptima, retire los medios de cultivo de cada poca y luego, fije las células incubando en 0,5 ml de 4% de PFA (diluido en 1X PBS) e incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
  4. Retire el fijador y lave los pozos tres veces con 1 ml de 1X PBS.
  5. A continuación, permeabilizar las células agregando 0.5 mL de 0.1% Triton-X-100 en 1X PBS a cada pozo e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
  6. Aspirar fuera del tampón de permeabilización y lavar los pozos tres veces con 1 mL de 1X PBS.
  7. Las células en los labios de cubierta ahora están fijas y permeabilizadas. Proceda al procedimiento de tinción demostrado para el siguiente ejemplo de inmunohistoquímica, con la excepción de que las incubaciones deben realizarse dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos en lugar de directamente en un portaobjetos de sección de tejido.

2. Preparación de secciones de formalina fija, incrustadas en parafina para la tinción

  1. Obtenga secciones de tejido sinua inadtemis preparadas y fijas en la formalina.

Desparaffinización

  1. Sumerja las diapositivas en 100% xileno 2 veces durante 5 min cada una.

Rehidratación

  1. Sumerja las diapositivas en etanol 100% 2 veces durante 3 min cada una.
  2. Sumerja las diapositivas en etanol al 95% durante 3 min.
  3. Sumerja las diapositivas en 70% de etanol durante 3 min.
  4. Sumerja las diapositivas en 50% de etanol durante 3 min.

Bloqueo de la actividad endógena de la peroxidasa

  1. Incubar los portaobjetos en 100 ml de 0,3% H2O2 durante 30 min a temperatura ambiente.
  2. Lave los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada uno.

Recuperación de antígenos

  1. Sumerja las diapositivas en el tampón de citrato IHC (pH 6) y herértelas durante 20 minutos.
  2. Las diapositivas de tejido ya están listas para la tinción.

3. Preparación de secciones de inmovilización fresca, OTC para la tinción

  1. Coloque 5 mm de tejido aislado fresco en un molde y agregue OCT hasta que la sección esté completamente cubierta.
  2. Sumerja lentamente el bloque de tejido en nitrógeno líquido hasta que se congele por completo. La muestra ahora se puede almacenar a -80 oC durante un máximo de 1 año.
  3. Una vez listo para el seccionamiento, transfiera el bloque de tejido congelado a un criostato y permita que toda la configuración llegue a -20 oC.
  4. Corte secciones de tejido grueso de 5-10 m con un criostato y use un cepillo para colocar secciones directamente en diapositivas de vidrio compatibles con IHC.
  5. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche a temperatura ambiente. Las diapositivas también se pueden almacenar a -80 oC.
  6. Sumerja los portaobjetos en 250 ml de 4% de PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente para fijar los portaobjetos antes de la tinción. El método de fijación óptimo debe ser determinado por el usuario.
  7. Sumerja las diapositivas en 250 ml de 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.
  8. Sumerja los portaobjetos en 250 ml de 0,3% H2O2 para 30 min a temperatura ambiente para bloquear cualquier actividad endógena de peroxidasa.
  9. Sumerja las diapositivas en 250 ml de 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.
  10. Las diapositivas ya están listas para la tinción.

4. Tinción

  1. Círculo del tejido con una barrera hidrófoba usando una pluma de barrera.

Bloqueo

  1. Usando una pipeta, coloque 100 l de tampón de bloqueo (suero de caballo diluido en 1X PBS) - sobre la sección durante 1 hora a temperatura ambiente.
  2. Retire el tampón de bloqueo con una pipeta.

Incubación de anticuerpos primarios

  1. Incubar el tejido rodeado con una solución de anticuerpos primarios diluido de 100 l (ciclina antihumana de ratón D1 diluida 1:100 en tampón de bloqueo) durante 30 min a temperatura ambiente.
  2. Escurrir el anticuerpo primario de cada portaobjetos y lavar los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 minutos cada uno.

Incubación Secundaria de Anticuerpos

  1. Incubar la muestra con 100 ml de anticuerpo secundario biotinilado diluido (IgG antiratón de caballo biotinilado diluido 1:200) durante 30 min a temperatura ambiente.
  2. Retire el anticuerpo secundario drenando las secciones y lávelo con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada una.

Desarrollo del color

  1. Visualización mediante HRP: Añadir 100 ml de reactivo complejo de avidina-biotina (ABC) e incubar las secciones en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente
    Nota: Los anticuerpos con etiquetas fluorescentes también se pueden utilizar y visualizar con un microscopio adecuado.
  2. Lave los portaobjetos con 1X PBS 2 veces durante 5 min cada uno.
  3. Desarrollar las diapositivas incubando las secciones en 100 s de DAB durante un máximo de 5 min.
  4. Detenga el desarrollo añadiendo agua destilada (dH2O) durante 5 min a temperatura ambiente.

Contramanchación (si se desea)

  1. Sumerja las diapositivas brevemente en Harris Hematoxylin Solution (o 0.5% de verde metilo en 0.1M de acetato de sodio (pH 4.2)) durante 10 min.
  2. Enjuague la contramancha lavando los portaobjetos en dH2O dos veces durante 5 min cada uno.

Deshidratación

  1. Sumerja las diapositivas en etanol al 95% 2 veces durante 5 min cada una.
  2. Sumerja las diapositivas en etanol 100% 2 veces durante 5 min cada una.
  3. Sumerja las diapositivas en 100% xileno 2 veces durante 5 min cada una.
  4. Sopla reline las diapositivas con una toalla de papel.

Aplicación de montaje y cubreobjetos

  1. Agregue una gota de soporte de montaje como Organo-Limoneene Mount a las diapositivas y coloque una tapa sobre las secciones.

Análisis microscópico

  1. Observe las secciones manchadas bajo un microscopio apropiado para el análisis. Aquí se utilizó un microscopio de luz estándar para la observación y se utilizó una cámara digital montada para la toma de imágenes.

La inmunocitoquímica y la inmunohistoquímica son métodos de tinción para una proteína de interés en las células y tejidos cultivados, respectivamente. El principio básico de ambas técnicas relacionadas implica el uso de anticuerpos específicos etiquetados con un sistema de detección para identificar y visualizar la proteína y determinar su ubicación dentro de las células y tejidos, así como los niveles relativos. El proceso en cualquiera de los experimentos comienza con la preparación de la muestra.

Para la inmunocitoquímica, que visualiza específicamente las ubicaciones de proteínas o antígenos en las células, esto implica tres pasos. El primer paso es el revestimiento, que implica el cultivo de las células en medios de crecimiento en un resbalón de cubierta o diapositiva, por lo general, en los pozos de una placa de cultivo. Esto es seguido por la fijación, donde un agente precipitante o reticulante como paraformaldehído se agrega a las células para preservar la integridad estructural de las proteínas y evitar que la actividad enzimática las degrade. El último paso es la permeabilización, que implica la adición de un detergente para hacer que las membranas celulares sean permeables para la tinción.

En el método homólogo, la inmunohistoquímica, las proteínas o los antígenos se visualizan en los tejidos y la preparación de la muestra tiene cinco pasos. En primer lugar, todo el tejido se somete a fijación, generalmente con paraformaldehído. Esto es seguido por la incrustación del tejido en un bloque de parafina, y luego la sección de este bloque usando una máquina llamada microtome para cortar el tejido en rodajas delgadas que se pueden colocar en diapositivas. A continuación, las diapositivas se someten a desparafinación, o eliminación de la parafina alrededor de la rebanada de tejido. A continuación, se puede realizar un paso opcional de recuperación de antígenos. Esto se puede hacer usando calor o enzimas para desenmascarar epítopos que fueron reticulados durante la fijación, haciéndolos disponibles para la unión de anticuerpos. Después de la preparación adecuada de la muestra, se agrega un anticuerpo primario específico del objetivo a la muestra de células o tejidos. Este anticuerpo primario debe unirse a la proteína de interés. A continuación, se añade un anticuerpo secundario, que detecta y se une al anticuerpo primario. Este anticuerpo secundario se conjuga con una enzima llamada HRP o puede unirse a ella. Cuando se añade su sustrato específico, DAB, HRP lo convierte en un precipitado marrón insoluble. Esta mancha marrón marca la ubicación de la proteína diana. Las diapositivas también están teñidas con hematoxilina, que etiqueta los núcleos en azul y proporciona un punto de referencia espacial para determinar la localización subcelular. Después de eso, el soporte de montaje se añade a la diapositiva, seguido de un deslizamiento de la cubierta con el fin de sellar y preservar la muestra manchada. Por último, las diapositivas se pueden crear imágenes en un microscopio de luz.

En este video, observará la técnica de preparación de muestras para células chapadas y secciones de tejido, seguida de inmunomanchación de las secciones de tejido.

En primer lugar, las células de interés deben sentarse en los labios de las cubiertas. Para ello, trabajando en una capucha de cultivo de tejido, coloque los cubredes individuales en los pozos de una placa de 24 pocillos. A continuación, cierre la faja y encienda la luz UV para esterilizar los labios de las cubiertas durante al menos 15 minutos. A continuación, apague la luz UV. Para levantar las células de interés de un plato de 10 centímetros confluente, aspirar el medio, lavar brevemente con PBS y agregar trippsina a las células durante 2 minutos. A continuación, toque el lado de la placa para asegurarse de que las células se han desprendido y neutralizar la trippsina con medios. A continuación, agregue 0. 5 ml de la suspensión celular en cada poca, asegurándose de cubrir los cubrecubiertas. Coloque la placa en una incubadora de CO2 humidificada y permita que las células crezcan a 37 grados centígrados hasta que sean de 50-70% de confluentes.

Una vez que las células alcanzan la confluencia óptima, aspirar el medio de cultivo de cada poca, y luego fijar las células incubando en . 5 ml de paraformaldehído 4% diluido en 1X PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el fijador, enjuague las células añadiendo 1 ml de 1X PBS sobre cada cubreobjetos. Aspirar inmediatamente el PBS, luego repetir el enjuague 2 veces más para un total de 3 lavados.

Ahora, permeablize las celdas agregando 0.5 mL de 0.1% Triton X-100 en 1X PBS a cada pozo. Deje el plato a temperatura ambiente durante 15 minutos. Aspirar fuera del búfer de permeabilización y luego enjuagar las células agregando 1 mL de 1X PBS en cada pozo. Aspirar inmediatamente el PBS y repetir el enjuague 2 veces más para un total de 3 lavados. Ahora que las células en los cubreobjetos están fijas y permeabilizadas, proceda al procedimiento de tinción demostrado para el siguiente ejemplo de inmunohistoquímica con la excepción de que las incubaciones deben realizarse dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos en lugar de directamente en una diapositiva de sección de tejido.

Para empezar, obtener secciones de tejido preparadas, fijas en formalina, incrustadas en parafina. Desparaffinizar las diapositivas colocándolas en un portaobjetos y luego sumergirlas por completo en 250 ml de 100% de xileno. Deje que las diapositivas se incuban durante 5 minutos en el xileno. A continuación, retire los portaobjetos del recipiente, límpielos con una toalla de papel y colóquelos en un nuevo baño de xileno en un recipiente nuevo durante otros 5 minutos.

A continuación, rehidrata las secciones de una serie de soluciones de etanol calificadas a partir del 100% de etanol durante 3 minutos. Limpie la portaobjetos con una toalla de papel y transfiera las diapositivas a un nuevo recipiente de etanol 100% durante otros 3 minutos. Continúe este ciclo de lavado, secado con una toalla de papel y transferencia de los portaobjetos a un nuevo baño siguiendo las concentraciones indicadas de etanol durante el tiempo especificado. Después del lavado final de etanol, limpie el estante con una toalla de papel e incubar los portaobjetos en 100 ml de peróxido de hidrógeno de .3% durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear cualquier actividad endógena de peroxidasa. Lave los portaobjetos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado en un recipiente de 1X PBS fresco durante 5 minutos adicionales.

A continuación, realice la recuperación de antígenos sumergiendo las diapositivas en 250 ml del tampón de citrato IHC a pH 6.0 y hirviéndolas durante 20 minutos. Luego, proceda al protocolo de tinción.

Para comenzar el proceso de tinción para IHC, circule las secciones con una pluma hidrófoba para identificar el área mínima que el tampón necesita cubrir. A continuación, utilice una pipeta para colocar 100 microlitros de tampón de bloqueo, que en este experimento es suero de caballo diluido en 1X PBS, sobre la sección. Incubar los toboganes durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de esto, retire el búfer de bloqueo utilizando una pipeta.

A continuación, diluir el anticuerpo primario y el tampón de bloqueo en una dilución de 1:100 mediante la adición de 990 microlitros de suero de caballo diluido en 1X PBS en un 1. Tubo Eppendorf de 5 ml, seguido de 10 microlitros del anticuerpo primario. Añadir 100 microlitros del anticuerpo primario diluido a cada sección, e incubar los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando suene el temporizador, drene el anticuerpo primario de cada diapositiva y luego lávelo en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado una vez más usando 1X PBS fresco.

Mientras que los portaobjetos se lavan en 1X PBS, diluir el anticuerpo secundario a una dilución 1:200 mediante la adición de 995 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de 1,5 ml seguido de 5 microlitros del anticuerpo secundario, que en este caso es biotinylated caballo anti-ratón IGG. Añadir 100 microlitros del anticuerpo secundario diluido a cada sección, y luego incubar los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, retire el anticuerpo secundario drenando las secciones, luego lave los portaobjetos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado con 1X PBS fresco.

Ahora, agregue 100 microlitros de reactivo complejo de avidina-biotina e incubar las secciones en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos sumergiéndolos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Al igual que los pasos de lavado anteriores, repita este lavado una vez más con el PBS 1X fresco. A continuación, desarrollar las diapositivas mediante la incubación de las secciones en 100 microlitros de DAB durante un máximo de 5 minutos. Detenga el desarrollo sumergiendo las secciones en 250 ml de agua destilada durante 5 minutos.

Ahora, las diapositivas se pueden contraconservar, si se desea. Para ello, sumerja brevemente los portaobjetos en 250 ml de Harris Hematoxylin Solution. Enjuagar la contramancha lavando los portaobjetos en 250 ml de agua destilada durante 5 minutos. Repita este lavado 1 vez más con agua fresca destilada. A continuación, deshidratar las secciones. Para ello, primero incubar los toboganes en etanol al 95% durante 5 minutos. Soplar los portaobjetos en una toalla de papel, y transferirlos a un nuevo recipiente de etanol fresco 95% durante otros 5 minutos. Continúe el ciclo de lavado, hinchando con una toalla de papel y transfiriendo los portaobjetos a un baño nuevo, siguiendo las soluciones indicadas durante 5 minutos cada uno.

Después de la incubación final, separen las diapositivas con una toalla de papel y, a continuación, agregue una gota de soporte de montaje, como el monte Organo-Limoneno, a las diapositivas. Ahora, coloque un cubreobjetos sobre las secciones, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire. Las diapositivas ya están listas para ser observadas bajo un microscopio para su análisis.

Para observar las secciones manchadas, utilice un microscopio de luz estándar para visualizar la mancha y una cámara digital para capturar la imagen. En este ejemplo particular de IHC, los tejidos del bazo de tipo salvaje y espontáneos, dobletransgénicos o ratones DTG, se comparan para estudiar la expresión de Dyclin D1 en el linfoma. Los tejidos estaban incrustados en parafina, seccionados y teñidos con anticuerpo anticiclina D1, y se imagearon con aumento 20 veces. Las células expresións de la ciclina D1 están indicadas por el color marrón rojizo sobre el fondo del tejido azul. Comparando las intensidades de tinción entre las imágenes de los diversos ratones, los bazos no agrandados tienen cantidades relativamente bajas de expresión de Cyclin D1 independientemente del genotipo del ratón. Por el contrario, el bazo agrandado del ratón DTG, muestra un aumento de la tinción de color marrón rojizo que indica una correlación entre el desarrollo del cáncer y la expresión de Ciclina D1 en este modelo de ratón.

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