Immunhistochemie und Immunzytochemie: Gewebebildgebung mittels Lichtmikroskopie

Immunzytochemie und Immunhistochemie sind Färbemethoden für ein Protein von Interesse in kultivierten Zellen bzw. Geweben. Das Grundprinzip beider verwandter Techniken besteht darin, spezifische Antikörper zu verwenden, die mit einem Detektionssystem markiert sind, um das Protein zu identifizieren und zu visualisieren und seine Position innerhalb der Zellen und Gewebe sowie die relativen Werte zu bestimmen. Der Prozess in beiden Experimenten beginnt mit der Probenvorbereitung.

Für die Immunzyztochemie, die speziell Protein- oder Antigenpositionen in Zellen visualisiert, umfasst dies drei Schritte. Der erste Schritt ist die Beschichtung, die die Kultivierung der Zellen in Wachstumsmedien auf einem Decksrutsch oder -schlitten, typischerweise, in den Brunnen einer Kulturplatte beinhaltet. Es folgt eine Fixierung, bei der den Zellen ein ausfällendes oder vernetzbares Mittel wie Paraformaldehyd zugesetzt wird, um die strukturelle Integrität der Proteine zu erhalten und zu verhindern, dass die Enzymaktivität sie abbaut. Der letzte Schritt ist die Permeabilisierung, bei der ein Reinigungsmittel hinzugefügt wird, um die Zellmembranen für die Färbung durchlässig zu machen.

Bei der Gegenmethode werden Immunhistochemie, Proteine oder Antigene in Geweben visualisiert und die Probenvorbereitung hat fünf Schritte. Zunächst wird das gesamte Gewebe fixiert, in der Regel mit Paraformaldehyd. Es folgt die Einbettung des Gewebes in einen Paraffinblock und dann das Schneiden dieses Blocks mit einer Maschine namens Mikrotome, um das Gewebe in dünne Scheiben zu schneiden, die auf Dias platziert werden können. Als nächstes werden die Dias einer Deparaffinierung oder Entfernung des Paraffins aus der Umgebung der Gewebescheibe unterzogen. Anschließend kann ein optionaler Antigen-Abrufschritt durchgeführt werden. Dies kann entweder mit Wärme oder Enzymen durchgeführt werden, um Epitope zu entlarven, die während der Fixierung vernetzt wurden, so dass sie für die Antikörperbindung zur Verfügung stehen. Nach der entsprechenden Probenvorbereitung wird der Zelle oder Gewebeprobe ein zielspezifischer Primärantikörper zugesetzt. Dieser primäre Antikörper sollte an das Protein von Interesse binden. Als Nächstes wird ein sekundärer Antikörper hinzugefügt, der den primären Antikörper erkennt und an ihn bindet. Dieser sekundäre Antikörper wird mit einem Enzym namens HRP konjugiert oder kann es binden. Wenn sein spezifisches Substrat DAB hinzugefügt wird, wandelt HRP dies in einen unlöslichen, braunen Niederschlag um. Dieser braune Fleck markiert die Position des Zielproteins. Die Dias sind auch mit Hämatoxylin befleckt, das die Kerne blau beschriftet und einen räumlichen Bezugspunkt zur Bestimmung der subzellulären Lokalisation bietet. Danach wird dem Dia Einbaumedien hinzugefügt, gefolgt von einem Abdeckschlupf, um die gebeizte Probe zu versiegeln und zu konservieren. Schließlich können die Dias auf einem Lichtmikroskop abgebildet werden.

In diesem Video beobachten Sie die Probenvorbereitungstechnik für plattierte Zellen und Gewebeabschnitte, gefolgt von der Immunfärbung der Gewebeabschnitte.

Zunächst müssen die Zellen von Interesse auf Deckellips sitzen. Dazu legen Sie bei der Arbeit in einer Gewebekulturhaube einzelne Deckel in die Brunnen einer 24-Well-Platte. Schließen Sie dann den Flügel und schalten Sie das UV-Licht ein, um die Abdeckungen mindestens 15 Minuten lang zu sterilisieren. Schalten Sie als Nächstes das UV-Licht aus. Um die von Interesse interessierten Zellen von einer konfluenten 10-Zentimeter-Schale zu heben, die Medien anzusaugen, kurz mit PBS zu waschen und trypsin für 2 Minuten in die Zellen zu geben. Tippen Sie dann auf die Seite der Platte, um sicherzustellen, dass sich die Zellen gelöst haben, und neutralisieren Sie das Trypsin mit Medien. Fügen Sie als Nächstes 0 hinzu. 5 ml der Zellsuspension in jedem Brunnen, stellen Sie sicher, dass die Abdeckungen abdeckung. Legen Sie die Platte in einen befeuchteten CO2-Inkubator und lassen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius wachsen, bis sie 50-70% konfluent sind.

Sobald die Zellen die optimale Konfluenz erreicht haben, aspirieren Sie das Kulturmedium aus jedem Brunnen und fixieren Sie die Zellen, indem Sie sie in in. 5 ml 4% Paraformaldehyd in 1X PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur verdünnt. Nach dem Entfernen des Fixativs spülen Sie die Zellen 1 ml 1X PBS über jeden Coverslip hinzu. Sofortiges Aspirieren der PBS, dann wiederholen Sie die Spülung 2 weitere Male für insgesamt 3 Wähbe.

Jetzt, permeablizieren Sie die Zellen durch Hinzufügen von 0,5 ml von 0,1% Triton X-100 in 1X PBS zu jedem Brunnen. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Saugen Sie den Permeabilisierungspuffer ab und spülen Sie die Zellen dann, indem Sie jedem Bohrkörper 1 ml 1X PBS hinzufügen. Sofortiges Absaugen der PBS und wiederholen Sie die Spülung 2 weitere Male für insgesamt 3 Wähbe. Nun, da die Zellen auf den Decklippen fixiert und permeabilisiert sind, gehen Sie mit dem Färbungsverfahren für das folgende Immunhistochemie-Beispiel mit der Ausnahme, dass die Inkubationen innerhalb der Brunnen der 24-Well-Platte durchgeführt werden sollten und nicht direkt auf einer Gewebesektionsrutsche.

Um zu beginnen, erhalten Sie vorbereitete, formalinfixierte, paraffin-eingebettete Gewebeabschnitte. Entparaffinisieren Sie die Dias, indem Sie sie in ein Diaregal legen und sie dann vollständig in 250 ml 100% Xylol eintauchen. Lassen Sie die Dias für 5 Minuten im Xylol brüten. Dann entfernen Sie die Rutschen aus dem Behälter, wischen Sie sie mit einem Papiertuch ab und legen Sie sie in ein neues Xylolbad in einem frischen Behälter für weitere 5 Minuten.

Als nächstes rehydrieren Sie die Abschnitte in einer Reihe von abgestuften Ethanol-Lösungen, beginnend mit 100% Ethanol für 3 Minuten. Wischen Sie das Schiebegestell mit einem Papiertuch ab und übertragen Sie die Dias für weitere 3 Minuten in einen neuen Behälter mit 100 % Ethanol. Setzen Sie diesen Zyklus des Waschens, Trocknens mit einem Papiertuch und der Übertragung der Dias in ein neues Bad nach den angegebenen Ethanolkonzentrationen für die angegebene Zeit fort. Nach dem letzten Ethanolwaschen das Gestell mit einem Papiertuch abwischen und die Dias in 100 ml von 0,3 % Wasserstoffperoxid 30 Minuten bei Raumtemperatur bebrüten, um eine endogene Peroxidaseaktivität zu blockieren. Waschen Sie die Dias in 250 ml 1X PBS für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese Wäsche in einem Behälter mit frischen 1X PBS für weitere 5 Minuten.

Als nächstes führen Sie antigen-retrieval durch, indem Sie die Dias in 250 ml IHC-Citratpuffer bei pH 6,0 eintauchen und 20 Minuten kochen. Fahren Sie dann mit dem Färbeprotokoll fort.

Um den Färbungsprozess für IHC zu beginnen, kreisen Sie die Abschnitte mit einem hydrophoben Stift, um den minimalen Bereich zu identifizieren, den der Puffer abdecken muss. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 100 Mikroliter Sperrpuffer, der in diesem Experiment Pferdeserum in 1X PBS verdünnt wird, über den Abschnitt zu legen. Inkubieren Sie die Dias für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie anschließend den Sperrpuffer mit einer Pipette.

Als nächstes verdünnen Sie den primären Antikörper und den Sperrpuffer bei einer Verdünnung von 1:100, indem Sie 990 Mikroliter Pferdeserum in 1X PBS zu einer 1 verdünnt enden. 5 mL Eppendorf-Röhre, gefolgt von 10 Mikrolitern des Primärantikörpers. Fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Primärantikörpers zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie die Dias 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Wenn der Timer ertönt, entleeren Sie den primären Antikörper von jedem Dia, und waschen Sie ihn dann in 250 ml 1X PBS für 5 Minuten. Wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal mit frischen 1X PBS.

Während die Dias in 1X PBS waschen, verdünnen Sie den sekundären Antikörper auf eine Verdünnung von 1:200, indem Sie 995 Mikroliter Blockierpuffer zu einem 1,5 ml Schlauch hinzufügen, gefolgt von 5 Mikrolitern des sekundären Antikörpers, der in diesem Fall biotinylierte Seimat-Anti-Maus-IGG ist. Fügen Sie 100 Mikroliter des verdünnten Sekundärantikörpers zu jedem Abschnitt hinzu und inkubieren Sie die Dias dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten den sekundären Antikörper entfernen, indem Sie ihn von den Abschnitten abtropfen lassen, und waschen Sie die Dias dann 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS. Wiederholen Sie diese Wäsche mit frischen 1X PBS.

Fügen Sie nun 100 Mikroliter Avidin-Biotin-Komplex-Reagenz hinzu und bebrüten die Abschnitte im Dunkeln 30 Minuten bei Raumtemperatur. Als nächstes waschen Sie die Dias, indem Sie sie 5 Minuten lang in 250 ml 1X PBS eintauchen. Ähnlich wie bei früheren Waschschritten, wiederholen Sie diese Wäsche noch einmal mit frischen 1X PBS. Als nächstes entwickeln Sie die Dias, indem Sie die Abschnitte in 100 Mikroliter DAB für bis zu 5 Minuten inkubieren. Stoppen Sie die Entwicklung, indem Sie die Abschnitte 5 Minuten lang in 250 ml destilliertes Wasser eintauchen.

Jetzt können Dias auf Wunsch gegengefärbt werden. Dazu tauchen Sie die Dias kurz in 250 ml Harris Hematoxylin Solution ein. Spülen Sie den Gegenfleck ab, indem Sie die Rutschen in 250 ml destilliertem Wasser für 5 Minuten waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche 1 weitere Zeit mit frischem destilliertem Wasser. Als nächstes dehydrieren Sie die Abschnitte. Um dies zu tun, zuerst inkubieren Sie die Dias in 95% Ethanol für 5 Minuten. Die Dias auf ein Papiertuch bumgen und für weitere 5 Minuten in einen neuen Behälter mit frischem 95% Ethanol geben. Setzen Sie den Zyklus des Waschens, Blotens mit einem Papiertuch und übertragen Sie die Rutschen in ein neues Bad, nach den angegebenen Lösungen für jeweils 5 Minuten.

Nach der letzten Inkubation die Dias mit einem Papiertuch bedrucken und dann einen Tropfen Montagemedien, wie Organo-Limonene Mount, zu den Dias hinzufügen. Platzieren Sie nun einen Deckelschlupf über die Abschnitte, wobei Sie darauf achten, keine Luftblasen einzufangen. Die Dias können nun unter dem Mikroskop zur Analyse beobachtet werden.

Um die gebeizten Abschnitte zu beobachten, verwenden Sie ein Standard-Lichtmikroskop, um den Fleck zu visualisieren, und eine Digitalkamera, um das Bild zu erfassen. In diesem speziellen Beispiel von IHC werden Milzgewebe von Wil-Typ und spontanen, doppeltransgenen oder DTG-Mäusen zur Untersuchung der Dyclin-D1-Expression bei Lymphomen verglichen. Die Gewebe wurden paraffin-eingebettet, geschnitten und mit Anticyclin-D1-Antikörpern gefärbt und mit 20-facher Vergrößerung abgebildet. Cyclin D1-exemittierte Zellen werden durch die rötlich-braune Farbe vor dem blauen Gewebehintergrund angezeigt. Vergleicht man die Färbeintensitäten zwischen den Bildern der verschiedenen Mäuse, so haben die nicht vergrößerten Milzen unabhängig vom Mausgenotyp relativ geringe Mengen an Cyclin-D1-Expression. Im Gegensatz dazu zeigt die vergrößerte Milz der DTG-Maus eine erhöhte rötlich-braune Färbung, die auf eine Korrelation zwischen Krebsentwicklung und Cyclin-D1-Expression in diesem Mausmodell hinweist.