Generación de anticuerpos: Producción de anticuerpos monoclonales mediante hibridatos

Immunology

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Concepts

Fuente: Frances V. Sjaastad1,2, Whitney Swanson2,3y Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Programa de Posgrado en Microbiología, Inmunología y Biología del Cáncer, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
2 Centro de Inmunología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
3 Departamento de Urología, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455
4 Centro De Cáncer Masónico, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN 55455

Los anticuerpos policlonales se definen como una colección de anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos de un antígeno o varios antígenos (1). Si bien los anticuerpos policlonales son herramientas poderosas para identificar moléculas biológicas, hay una limitación importante: son incapaces de distinguir entre antígenos que comparten determinantes antigénicos. Por ejemplo, cuando se utiliza albúmina sérica bovina para inmunizar a un animal, las células B con diferentes superficies Ig responderán a diferentes determinantes antigénicos en la albúmina sérica bovina. El resultado es una mezcla de anticuerpos en el antisuero. Debido a que la albúmina sérica bovina comparte algunos epítopos con albúmina sérica humana en regiones evolutivamente conservadas de la proteína, este antisuero de albúmina sérica antibovina también reaccionará con albúmina sérica humana. Por lo tanto, este antisuero no será útil para distinguir entre albúminas de suero bovino y humano.

Se han adoptado varios enfoques para superar el problema de especificidad de los antisueros policlonales. Una es absorbiendo los anticuerpos no deseados pasando el antisuero a través de una columna de cromatografía de antígenos inmovilizados (2). Este método es tedioso y con frecuencia incapaz de eliminar completamente los anticuerpos no deseados. Otro enfoque es aislar las células B productoras de anticuerpos individuales y expandirlas en cultivo. Sin embargo, como la mayoría de las células no transformadas normales, las células B no sobreviven en el cultivo a largo plazo.

Para superar la incapacidad de las células B para sobrevivir en el cultivo, un enfoque es preparar un hibrioma de células mieloma-B. En 1847, Henry Bence-Jones descubrió que los pacientes con mieloma múltiple, un tumor linfoide, producían una gran cantidad de anticuerpos (3). Las células B de estos pacientes se han vuelto malignas y crecen incontrolablemente. Dado que las células B malignas se derivan de un solo clon, son idénticas y producen un solo tipo de anticuerpo(es decir,un anticuerpo monoclonal o mAb). Sin embargo, la mayoría de estas células del mieloma producen anticuerpos de especificidades desconocidas. En 1975, al fusionar una célula de mieloma a una célula B, Cesar Milstein y Georges Kohler lograron producir un hibrioma que se puede cultivar indefinidamente in vitro y produce un número ilimitado de anticuerpos monoclonales de especificidad antigénica conocida (4). La razón de trás de su enfoque es combinar las propiedades inmortales de la célula del mieloma y el anticuerpo que produce propiedades de la célula B. Su técnica revolucionó la producción de anticuerpos y proporciona un poderoso medio para la identificación y purificación de moléculas biológicas utilizando anticuerpos monoclonales.

Generalmente, preparar un anticuerpo monoclonal requiere varios meses. El procedimiento general incluye los siguientes pasos:

  1. Inmunización y cribado del título de anticuerpos
  2. Fusión de células B productoras de anticuerpos y células de mieloma
  3. Crecimiento selectivo del hybridoma
  4. Detección de los hibridatos para producir el anticuerpo monoclonal deseado
  5. Clonación mediante la limitación de la dilución - un proceso por el que las células se diluyen a una concentración para permitir estadísticamente que se agregue menos de 1 célula a los pozos de una placa de 96 pocillos. Algunos pozos terminarán con 0 células y algunos tendrán 1 célula. Los pozos con sembrados con 1 célula eventualmente crecerán en una población monoclonal de células.
  6. Crecimiento del hibridado y preparación de anticuerpos monoclonales

Este protocolo se centra en el último paso : el crecimiento del hibrioma y la preparación del anticuerpo monoclonal. El anticuerpo se purifica del sobrenadante de cultivo mediante precipitación de sulfato de amonio (a menudo conocida como salazón) - un método comúnmente utilizado para eliminar proteínas de una solución. Las proteínas en solución forman enlaces de hidrógeno, junto con otras interacciones hidrófilas, con el agua a través de sus grupos polares e iónicos expuestos. Cuando se añaden concentraciones de iones pequeños y altamente cargados (como amonio o sulfato), estos grupos compiten con las proteínas para unirse al agua. Esto elimina las moléculas de agua de la proteína y disminuye su solubilidad, lo que resulta en la precipitación de la proteína.

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JoVE Science Education Database. Inmunología. Generación de anticuerpos: Producción de anticuerpos monoclonales mediante hibridatos. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

Nota: La técnica de cultivo celular estéril debe mantenerse al manipular las células del hibrioma y los medios de comunicación de una manera estéril (por ejemplo, en un gabinete de bioseguridad) hasta que la purificación de anticuerpos sea pisada.

1. Descongelar las células de hibrido congelado

  1. Incubar el vial que contiene las células de hibrioma congeladas en un baño de agua a 37oC hasta que solo se descongele (aproximadamente 2 minutos).
  2. Añadir las células descongeladas a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de RPMI completo (RPMI complementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 1 mM de piruvato sódico, 1x aminoácidos no esenciales, 50 M 2-Mercaptoetanol, 10 mM de HEPES).
  3. Centrífuga durante 5 min a 1200 RPM para lavar cualquier medio de congelación contaminante.
  4. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante líquido y resuspenda el pellet celular en 5 ml de RPMI completo fresco. A continuación, agregue las células a un matraz de cultivo de tejido T75 que contenga 15 ml de RPMI completo (el volumen final de RPMI es de 20 ml).
  5. Cultivar las células en una incubadora estándar a 37oC con un 5% deCO2. Las células no son adherentes mientras están en cultivo.

2. Expansión de Hybridoma

  1. Permita que las células se expandan durante aproximadamente 3 días hasta que el matraz sea confluente del 80%.
    Nota: Esta cantidad de tiempo puede variar en función del número inicial de células, así como las diferencias inherentes en las tasas de crecimiento de diferentes células. Es importante que las células estén en la fase de crecimiento exponencial.
  2. Una vez que el matraz inicial alcance una confluencia del 80 %, retire las células de este matraz T75 inicial, colóquelas en un tubo centrífugo cónico y gire (1200 RPM durante 5 min) para peletizar las células.
  3. Resuspenda las células en 6 ml de RPMI completo y luego distribuya la suspensión celular en tres nuevos matraces T75 (2 ml/matraz que contienen 18 ml de RPMI). Incubar estos tres matraces T75 a 37oC con 5% deCO2 hasta que sean confluentes del 80% (Esto debe tomar aproximadamente 3 días).

3. Producción de anticuerpos en el medio libre de suero

Nota: En este punto, las células están listas para continuar su crecimiento en un medio libre de suero diseñado para el crecimiento de las líneas celulares de hibrido. En este protocolo, utilizamos el medio líquido basal HB listo para usar y disponible comercialmente que contiene el producto de suplemento HB101.

  1. Las células de cada uno de los tres matraces T75 (con una confluencia del 80%) se recogen y centrifugan (1200 RPM durante 5 min).
  2. El pellet celular de cada matraz T75 se resuspende en un medio sin suero HB101 suplementado de 10 ml y luego se añade a dos matraces T225 suplementados con HB101 (es decir, suspensión celular de 5 ml en cada uno de 6 matraces que contienen 220-240 ml de HB01 en cada matraz).
  3. Continúe cultivando las células en matraces T225 y medios HB101 a 37oC con 5% deCO2 durante tres semanas, o hasta que las células comiencen a morir. Las células están produciendo mAb durante estas 3 semanas y secretándolo en el medio de cultivo. Una vez que las células están empezando a morir, ya no están produciendo ningún mAb.

4. Purificación de anticuerpos - Día 1

Nota: En este punto, no es necesario mantener la esterilidad, por lo que no es necesario manipular los medios de forma estéril (por ejemplo, en un gabinete de bioseguridad). Además, los hibriomas no se consideran un agente de "nivel BSL2".

  1. Vierta los medios de los matraces en tubos para un rotor de ángulo fijo. Gire los tubos en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo a 10.000 RPM durante 8 minutos. Este paso está diseñado para eliminar los desechos celulares del sobrenadante de cultivo.
    Nota: Los tamaños de los tubos pueden variar dependiendo del rotor utilizado. Lo importante a recordar es tener el mismo volumen en los tubos para asegurar que el rotor esté correctamente equilibrado antes de la centrifugación. Es probable que todo el volumen de los medios de comunicación no encaje en la centrífuga a la vez. El resto de los medios se centrifugarán más adelante (paso 4.5) utilizando los mismos tubos.
  2. Prepare un vaso de precipitados de plástico 2L con una barra de agitación en un cubo rodeado de hielo. Colocar en un plato de agitación.
  3. Coloque una tapa de filtro de 500 ml en una botella de 1L. Coloque la unidad de filtro de la tapa de la botella para albergar el vacío a través de un tubo apropiado.
  4. Vierta el sobrenadante del paso 4.1 (que todavía contiene el mAb producido por las células del hibrioma) en la parte superior del filtro.
  5. Continúe utilizando el mismo conjunto de tubos para los desechos de células de pellets de los medios (el pellet continuará construyéndose). Espere a ejecutar la aspiradora hasta que la parte superior del filtro esté llena y otro lote de sobrenadante esté listo para verter. No deje que el filtro se seque o el filtrado será muy lento.
  6. Cuando la botella de 1L esté casi llena, retire la tapa del filtro y vierta el sobrenadante en el vaso de precipitados 2L preparado en el paso 4.2. Vuelva a colocar la parte superior del filtro. Realice un seguimiento del volumen.
  7. Repita los pasos de centrifugación y filtración hasta que se procese todo el medio.
  8. Mida 295 g de sulfato de amonio por 1L de sobrenadante filtrado recogido. Mientras se agita, agregue lentamente el sulfato de amonio al sobrenadante durante las próximas horas (25 g cada 15 minutos) para evitar una alta concentración localizada de sal de sulfato de amonio que puede hacer precipitar proteínas no deseadas.
  9. Una vez que se haya añadido todo el sulfato de amonio, cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y muévalo con la placa de agitación a 4oC (p. ej., refrigerador a pie o sala fría). Revuelve durante la noche. Se requiere agitación constante de la solución para solubilizar la sal, pero la agitación prolongada puede conducir a la desnaturalización de las proteínas en la solución en la interfaz superficie/aire.
  10. Lave los tubos con el rotor de ángulo fijo.

5. Purificación de anticuerpos - Día 2

  1. Vierta el sobrenadante que contiene amonio del vaso de precipitados 2L en tubos para un rotor de ángulo fijo. Gire en centrífuga con rotor de ángulo fijo a 6500 RPM durante 20 minutos sin freno.
  2. Aspirar aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no chupar el pellet, ya que será suave. Continúe utilizando el mismo conjunto de tubos para recoger el pellet del sobrenadante que contiene amonio-sulfato.
  3. Después de la última aspiración, resuspenda cada pellet (que contiene anticuerpos) en PBS de 1 ml.
  4. Retire el sulfato de amonio de la solución precipitada de mAb mediante diálisis contra grandes volúmenes de PBS. Para ello, primero corte aproximadamente 1 pulgada de tubería de diálisis (por ejemplo, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 Tubo de diálisis de celulosa de corte Dalton) por cada ml de solución de mAb. Humedezca el tubo con dH2O. Ate un nudo en un extremo del tubo y llene con dH2O para comprobar que el nudo no se filtre. Vacío dH2O del tubo.
  5. Pipetear la solución de anticuerpos/PBS en el tubo. Enjuague los tubos con 0,25 ml de PBS adicional y transfiera al tubo.
  6. Asegure la parte superior del tubo lo más cerca posible de la solución con un clip de diálisis naranja.
  7. Pegue la parte superior del tubo en la parte superior exterior de un vaso de precipitados 4L. Deje que la parte llena del tubo cuelgue en el vaso de precipitados. Llene el vaso de precipitados con PBS y agregue una barra de agitación.
  8. Revuelva durante la noche durante 8 horas a 4oC.
  9. Sustituya el PBS en el vaso de precipitados por PBS fresco y revuelva durante 8 horas dos veces más.
  10. Transfiera el anticuerpo del tubo a tubos cónicos de 15 o 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1200 RPM para eliminar cualquier precipitado que pueda haberse formado. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
  11. Diluir una alícuota de anticuerpos 1:20 con PBS (anticuerpo de 5 l + PBS de 95 l). Cantidad de la concentración de anticuerpos con un espectrofotómetro (en blanco con PBS) a 280 nm. Utilice un coeficiente de extinción de 1,43. La concentración se calcula como

  12. Alícuota el anticuerpo en viales de tapa de tornillo y guárdelo a -80oC.

Los anticuerpos son una poderosa herramienta para la investigación y el diagnóstico, lo que significa que a menudo es necesario producirlos en grandes cantidades.

El primer paso para generar anticuerpos es inyectar el antígeno de interés en un animal huésped. El antígeno activa las células B del huésped que luego producen y liberan anticuerpos específicos de ese antígeno. A continuación, se realiza un cribado regular de los antisueros del animal huésped para detectar la presencia del anticuerpo diana, utilizando ELISA u otro método de detección. Una vez detectado, se extrae el bazo del animal huésped, que contiene las células B. Si todas las células B del bazo están ahora aisladas, esto debería incluir una población que segrega anticuerpos contra el antígeno de interés. Nos referimos a esta población como policlonal, porque cada célula probablemente ligada a un epítopo diferente del antígeno, y por lo tanto, generó su propio anticuerpo individual y único.

Para generar anticuerpos monoclonales, los anticuerpos elevados para reconocer un epítopo específico, la célula B individual que produce el anticuerpo deseado primero debe aislarse y cultivarse. Desafortunadamente, las células B no sobreviven bien en el cultivo. Así que para superar este obstáculo, los científicos fusionan las células B con células de mieloma inmortales, lo que resulta en hibridatos. Estas células se cultivan en un medio selectivo que sólo permite que los hibridatos crezcan y liberen anticuerpos. Una vez más, el medio se examinan utilizando un método como ELISA para el anticuerpo deseado. Una vez detectados, los hibriomas se clonan a través de un proceso llamado dilución limitante, una dilución en serie del cultivo padre, que debería dar lugar a que las células individuales se salpiquen en los pozos de una placa de cribado. Esto permite el crecimiento de hibridatos a partir de una sola célula madre, produciendo una línea celular monoclonal que sólo libera el anticuerpo deseado. Estas líneas monoclonales se pueden expandir en frascos de cultivo de tejido para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales. Después de esto, a medida que las células comienzan a morir, los anticuerpos se pueden precipitar desde el medio con sulfato de amonio. Normalmente, en solución, los anticuerpos interactúan con el agua a través de interacciones hidrófilas. Sin embargo, el amonio y el sulfato son iones altamente cargados que separan las moléculas de agua de los anticuerpos, disminuyendo la solubilidad de los anticuerpos y haciendo que se precipiten.

Para empezar, primero compruebe la lista de materiales y prepare todos los medios, suministros y superficies de trabajo para el protocolo.

Luego, encienda un baño de agua y colóquelo en 37 grados Centígrados. A continuación, agregue 10 mililitros de RPMI completo a un tubo cónico de 15 mililitros y 15 mililitros de RPMI completo a un matraz de cultivo celular T75 y déjalos a un lado. Con precaución y usando el equipo de protección personal adecuado, retire el vial congelado que contiene células de hybridoma del almacenamiento de nitrógeno líquido. Para liberar la presión dentro del vial, afloje ligeramente la tapa. Ahora, incubar cuidadosamente el vial en el baño de agua, asegurándose de que la tapa permanece por encima de la superficie del agua para minimizar las posibilidades de contaminación. Cuando las células estén casi desconadas, que normalmente toma alrededor de dos minutos, mueva el vial a la capucha del cultivo de tejido.

A continuación, limpie el exterior del vial con 70% de etanol antes de retirar la tapa. Con una pipeta estéril, transfiera las células al tubo cónico que contiene 10 mililitros de medio RPMI completo. Luego, centrifugar el tubo durante cinco minutos a 1200 RPM. Después de la centrifugación, mueva el tubo de nuevo a la capucha de tejido y limpie el exterior del tubo con etanol. Sin molestar el pellet, deseche el sobrenadante y luego agregue cinco mililitros de medio RPMI completo fresco y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender. A continuación, transfiera las células al matraz de cultivo celular T75 y coloque el matraz dentro de una incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados. Permita que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, que generalmente toma alrededor de tres días. Observe que las células de hybridoma no son adherentes y crecerán suspendidas en el medio. El tiempo para alcanzar suficiente confluencia puede variar en función del número inicial de células vivas y el tipo de célula de hibribio utilizado.

Una vez que las células sean lo suficientemente confluentes, utilice una pipeta estéril de 25 mililitros para transferirlas desde el matraz de cultivo a un tubo centrífugo cónico. Reventar las células por centrifugación a 1200 RPM durante cinco minutos. Mientras que las células están en la centrífuga, agregue 18 mililitros de RPMI completo en cada uno de los tres nuevos matraces de cultivo celular T75 y deje estos a un lado. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular en seis mililitros de RPMI completo. A continuación, agregue dos mililitros de la suspensión celular en cada uno de los tres nuevos matraces de cultivo celular. Finalmente, coloque los matraces en una incubadora establecida en 5% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius e incubar hasta que los matraces sean alrededor del 80% de confluentes, aproximadamente tres días.

En este punto, las células están listas para continuar su crecimiento en el medio libre de suero diseñado para líneas celulares de hibrido, como el medio líquido basal HB disponible comercialmente que contiene el suplemento HB101. Transfiera las células de cada matraz de cultivo celular a tubos cónicos de centrífuga y luego peletizar las células por centrifugación a 1200 RPM durante cinco minutos. Ahora, agregue 230 mililitros de medio libre de suero HB101 complementado en cada uno de los seis matraces de cultivo celular de 225 centímetros cuadrados y déjalos a un lado. Una centrifugación completa, retire el sobrenadante y resuspenda cada pellet en 10 mililitros de medio HB101 suplementario. Luego, en cada matraz de cultivo celular, agregue cinco mililitros de la suspensión celular. Coloque los matraces en la incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados Centígrados y continúe cultivando las células durante unas tres semanas. Durante este tiempo, las células producirán y liberarán el anticuerpo monoclonal de interés en el medio de cultivo y el anticuerpo estará listo para la purificación cuando las células comiencen a morir.

Para eliminar los desechos celulares de los medios de cultivo que contienen anticuerpos, vierta el contenido de los matraces de cultivo en tubos para un rotor de ángulo fijo. Coloque los tubos en el rotor y asegúrese de que esté nado correctamente antes de la centrifugación. Gire los tubos a 10.000 RPM durante ocho minutos. Mientras las muestras son centrifugadoras, coloque un vaso de precipitados de plástico de dos litros con una barra de agitación en un cubo de hielo y luego coloque el cubo de hielo en un plato de agitación.

A continuación, coloque una tapa de filtro de 500 mililitros en una botella de un litro. Conecte esta unidad de filtro superior a una casa utilizando el tubo adecuado. A continuación, vierta el sobrenadante que contiene el anticuerpo en la parte superior del filtro. Centrifugar el medio restante para separar los desechos celulares del sobrenadante que contiene anticuerpos. Cuando la parte superior del filtro esté llena de sobrenadant, inicie el vacío. Luego, cuando la botella de recolección de un litro esté casi llena, retire la tapa del filtro y vierta el sobrenadante filtrado en el vaso de precipitados de dos litros sobre hielo. Repita los pasos de filtración hasta que se procese todo el sobrenadante.

Cuando toda la muestra haya sido procesada, pese 295 gramos de sulfato de amonio por cada litro de sobrenadante filtrado. Comience la placa de agitación y agregue lentamente el sulfato de amonio al sobrenadante durante las próximas horas. Esto evita una alta concentración localizada de sal de sulfato de amonio que puede hacer precipitar proteínas no deseadas. Una vez que se haya añadido todo el sulfato de amonio, cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y muévalo, junto con la placa de agitación, a una cámara fría a cuatro grados centígrados y póngalo para agitar la solución de anticuerpos durante la noche.

A la mañana siguiente, vierta la solución de anticuerpos que contiene sulfato de amonio del vaso de precipitados de dos litros en tubos limpios para el rotor de ángulo fijo. Centrifugar los tubos a 6500 RPM durante 20 minutos sin romper para peletizar el anticuerpo en la parte inferior de los tubos. A continuación, aspirar el sobrenadante, usando precaución para no chupar el pellet suave. Continúe utilizando el mismo conjunto de tubos para recoger el anticuerpo peletado del resto del sobrenadante que contiene sulfato de amonio. Después de la última aspiración, vuelva a suspender cada pellet de anticuerpos en aproximadamente un mililitro de PBS.

Para eliminar el sulfato de amonio de la solución de anticuerpos, primero corte aproximadamente una pulgada de tubo de diálisis para cada mililitro de solución de anticuerpos. A continuación, limpie el tubo con agua destilada y ate un nudo en un extremo del tubo. Llene el tubo con agua destilada para comprobar si hay fugas del nudo. Si no hay fugas después de unos minutos, vacíe el agua del tubo.

A continuación, pipetear la solución de anticuerpos en el tubo. Para recuperar tantos anticuerpos como sea posible, enjuague los tubos con 0,25 mililitros adicionales de PBS y transfiera esto también al tubo. Asegure la parte superior del tubo lo más cerca posible de la solución con un clip de diálisis. Luego, pegue la parte superior del tubo en la parte superior exterior de un vaso de precipitados de cuatro litros con la parte llena del tubo colgando en el vaso de precipitados. Ahora, lleve el vaso de precipitados a la sala fría de cuatro grados Celsius y colóquelo en un plato de agitación. Llene el vaso de precipitados hasta la parte superior con PBS y agregue una barra de agitación. Deje que el tubo y la solución se revuelvan durante aproximadamente ocho horas. A la mañana siguiente, reemplace el PBS en el vaso de precipitados con PBS fresco y luego deje el vaso de precipitados para agitar de nuevo durante aproximadamente ocho horas. Más tarde esa noche, repita el proceso una última vez. Por la mañana, abra el tubo de diálisis y luego transfiera la solución de anticuerpos del tubo a tubos cónicos de 15 mililitros. Para eliminar cualquier precipitante que se haya formado durante la diálisis, centrifugar los tubos durante cinco minutos a 1200 RPM. Finalmente, transfiera el sobrenadante a tubos nuevos.

Para cuantificar la concentración de anticuerpos, primero haga una dilución de 20 veces añadiendo cinco microlitros de una alícuota de anticuerpos a 95 microlitros de PBS. A continuación, pipetear el anticuerpo diluido en una cubeta y utilizar un espectrofotómetro para registrar la concentración en 280 nanómetros. A continuación, calcule la concentración de anticuerpos utilizando la fórmula que se muestra. Por último, etiquete los viales de la tapa del tornillo con el nombre del anticuerpo, la concentración, la fecha de preparación y, si corresponde, el número de lote y el nombre del experimentador, y luego alíbe el anticuerpo en los viales de la tapa del tornillo etiquetados. Estos se pueden almacenar a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario.

Ejemplo de rendimientos utilizando la línea de hibrigoma 120G8 anti-ratón CD317 o PDCA-1 oscilaron entre 44 y 99,6 miligramos, que normalmente produce, en promedio, 67,3 miligramos de cantidad. Es importante tener en cuenta que cada ejecución de producción con la misma línea celular de hybridoma puede ser ligeramente diferente en la cantidad de anticuerpos monoclonales disponibles al final.

Results

Utilizando este protocolo, hemos obtenido los siguientes resultados con varios hibridadores diferentes:

Hibridama: RB6-BC5 (rat anti-ratón Ly6C/Ly6G (Gr1) IgG2b, mAb)
OD280 - 1.103
(1.103/1.43) (20) á 15,42 mg/ml

Hibridama: GK1.5 (rat antiratón CD4 IgG2b, mAb)
OD280 - 0.485
(0.485/1.43) (20) 6,78 mg/ml

Hibridama: 2.43 (rat antiratón CD8 IgG2b, mAb)
OD280 - 0.209
(0.209/1.43) (20) á 2,92 mg/ml

Todos estos son resultados de ejemplo, y es importante tener en cuenta que cada ejecución de producción con el mismo hibrioma puede ser ligeramente diferente en la cantidad de mAb disponible al final.

Applications and Summary

El procedimiento descrito anteriormente es una forma sencilla y directa de purificar los anticuerpos monoclonales del sobrenadante del cultivo del híbrido. Es importante recordar, sin embargo, que el sulfato de amonio precipitará otras proteínas que pueden estar en el cultivo sobrenadante. En consecuencia, las concentraciones de anticuerpos determinadas a partir de las mediciones de absorbancia son estimaciones. El usuario puede evaluar la pureza de la muestra dializada ejecutando una pequeña cantidad en un gel de poliacrilamida SDS. El mAb producido por un hibrioma, una vez purificado usando esta metodología, se puede utilizar de diversas maneras. Los descritos anteriormente RB6-BC5, GK1.5, y 2.43 mAb se utilizan comúnmente para el agotamiento in vivo de neutrófilos, células T CD4, y células T CD8, respectivamente, en ratones. Otros mAb producidos y purificados usando este protocolo se pueden utilizar para la citometría de flujo (cuando se conjugan con un fluoróforo o en combinación con un Ab secundario), ELISA, o la hincha occidental.

References

  1. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal versus polyclonal antibodies: distinguishing characteristics, applications, and information resources. ILAR Journal, 46 (3), 258-268 (2005).
  2. Arora S, Ayyar BV, O'Kennedy R. Affinity chromatography for antibody purification Methods Mol Biol. 1129, 497-516 (2014).
  3. Henry BJ. On a new substance occurring in the urine of a patient with mollities ossium. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 138, 55-62 (1848).
  4. Köhler G and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature. 256, 495-497 (1975).

Nota: La técnica de cultivo celular estéril debe mantenerse al manipular las células del hibrioma y los medios de comunicación de una manera estéril (por ejemplo, en un gabinete de bioseguridad) hasta que la purificación de anticuerpos sea pisada.

1. Descongelar las células de hibrido congelado

  1. Incubar el vial que contiene las células de hibrioma congeladas en un baño de agua a 37oC hasta que solo se descongele (aproximadamente 2 minutos).
  2. Añadir las células descongeladas a un tubo cónico de 15 ml que contenga 10 ml de RPMI completo (RPMI complementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U/ml de penicilina, 100 g/ml de estreptomicina, 1 mM de piruvato sódico, 1x aminoácidos no esenciales, 50 M 2-Mercaptoetanol, 10 mM de HEPES).
  3. Centrífuga durante 5 min a 1200 RPM para lavar cualquier medio de congelación contaminante.
  4. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante líquido y resuspenda el pellet celular en 5 ml de RPMI completo fresco. A continuación, agregue las células a un matraz de cultivo de tejido T75 que contenga 15 ml de RPMI completo (el volumen final de RPMI es de 20 ml).
  5. Cultivar las células en una incubadora estándar a 37oC con un 5% deCO2. Las células no son adherentes mientras están en cultivo.

2. Expansión de Hybridoma

  1. Permita que las células se expandan durante aproximadamente 3 días hasta que el matraz sea confluente del 80%.
    Nota: Esta cantidad de tiempo puede variar en función del número inicial de células, así como las diferencias inherentes en las tasas de crecimiento de diferentes células. Es importante que las células estén en la fase de crecimiento exponencial.
  2. Una vez que el matraz inicial alcance una confluencia del 80 %, retire las células de este matraz T75 inicial, colóquelas en un tubo centrífugo cónico y gire (1200 RPM durante 5 min) para peletizar las células.
  3. Resuspenda las células en 6 ml de RPMI completo y luego distribuya la suspensión celular en tres nuevos matraces T75 (2 ml/matraz que contienen 18 ml de RPMI). Incubar estos tres matraces T75 a 37oC con 5% deCO2 hasta que sean confluentes del 80% (Esto debe tomar aproximadamente 3 días).

3. Producción de anticuerpos en el medio libre de suero

Nota: En este punto, las células están listas para continuar su crecimiento en un medio libre de suero diseñado para el crecimiento de las líneas celulares de hibrido. En este protocolo, utilizamos el medio líquido basal HB listo para usar y disponible comercialmente que contiene el producto de suplemento HB101.

  1. Las células de cada uno de los tres matraces T75 (con una confluencia del 80%) se recogen y centrifugan (1200 RPM durante 5 min).
  2. El pellet celular de cada matraz T75 se resuspende en un medio sin suero HB101 suplementado de 10 ml y luego se añade a dos matraces T225 suplementados con HB101 (es decir, suspensión celular de 5 ml en cada uno de 6 matraces que contienen 220-240 ml de HB01 en cada matraz).
  3. Continúe cultivando las células en matraces T225 y medios HB101 a 37oC con 5% deCO2 durante tres semanas, o hasta que las células comiencen a morir. Las células están produciendo mAb durante estas 3 semanas y secretándolo en el medio de cultivo. Una vez que las células están empezando a morir, ya no están produciendo ningún mAb.

4. Purificación de anticuerpos - Día 1

Nota: En este punto, no es necesario mantener la esterilidad, por lo que no es necesario manipular los medios de forma estéril (por ejemplo, en un gabinete de bioseguridad). Además, los hibriomas no se consideran un agente de "nivel BSL2".

  1. Vierta los medios de los matraces en tubos para un rotor de ángulo fijo. Gire los tubos en una centrífuga con un rotor de ángulo fijo a 10.000 RPM durante 8 minutos. Este paso está diseñado para eliminar los desechos celulares del sobrenadante de cultivo.
    Nota: Los tamaños de los tubos pueden variar dependiendo del rotor utilizado. Lo importante a recordar es tener el mismo volumen en los tubos para asegurar que el rotor esté correctamente equilibrado antes de la centrifugación. Es probable que todo el volumen de los medios de comunicación no encaje en la centrífuga a la vez. El resto de los medios se centrifugarán más adelante (paso 4.5) utilizando los mismos tubos.
  2. Prepare un vaso de precipitados de plástico 2L con una barra de agitación en un cubo rodeado de hielo. Colocar en un plato de agitación.
  3. Coloque una tapa de filtro de 500 ml en una botella de 1L. Coloque la unidad de filtro de la tapa de la botella para albergar el vacío a través de un tubo apropiado.
  4. Vierta el sobrenadante del paso 4.1 (que todavía contiene el mAb producido por las células del hibrioma) en la parte superior del filtro.
  5. Continúe utilizando el mismo conjunto de tubos para los desechos de células de pellets de los medios (el pellet continuará construyéndose). Espere a ejecutar la aspiradora hasta que la parte superior del filtro esté llena y otro lote de sobrenadante esté listo para verter. No deje que el filtro se seque o el filtrado será muy lento.
  6. Cuando la botella de 1L esté casi llena, retire la tapa del filtro y vierta el sobrenadante en el vaso de precipitados 2L preparado en el paso 4.2. Vuelva a colocar la parte superior del filtro. Realice un seguimiento del volumen.
  7. Repita los pasos de centrifugación y filtración hasta que se procese todo el medio.
  8. Mida 295 g de sulfato de amonio por 1L de sobrenadante filtrado recogido. Mientras se agita, agregue lentamente el sulfato de amonio al sobrenadante durante las próximas horas (25 g cada 15 minutos) para evitar una alta concentración localizada de sal de sulfato de amonio que puede hacer precipitar proteínas no deseadas.
  9. Una vez que se haya añadido todo el sulfato de amonio, cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y muévalo con la placa de agitación a 4oC (p. ej., refrigerador a pie o sala fría). Revuelve durante la noche. Se requiere agitación constante de la solución para solubilizar la sal, pero la agitación prolongada puede conducir a la desnaturalización de las proteínas en la solución en la interfaz superficie/aire.
  10. Lave los tubos con el rotor de ángulo fijo.

5. Purificación de anticuerpos - Día 2

  1. Vierta el sobrenadante que contiene amonio del vaso de precipitados 2L en tubos para un rotor de ángulo fijo. Gire en centrífuga con rotor de ángulo fijo a 6500 RPM durante 20 minutos sin freno.
  2. Aspirar aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no chupar el pellet, ya que será suave. Continúe utilizando el mismo conjunto de tubos para recoger el pellet del sobrenadante que contiene amonio-sulfato.
  3. Después de la última aspiración, resuspenda cada pellet (que contiene anticuerpos) en PBS de 1 ml.
  4. Retire el sulfato de amonio de la solución precipitada de mAb mediante diálisis contra grandes volúmenes de PBS. Para ello, primero corte aproximadamente 1 pulgada de tubería de diálisis (por ejemplo, Membra-Cel MD25-14 MWCO 12,000-14,000 Tubo de diálisis de celulosa de corte Dalton) por cada ml de solución de mAb. Humedezca el tubo con dH2O. Ate un nudo en un extremo del tubo y llene con dH2O para comprobar que el nudo no se filtre. Vacío dH2O del tubo.
  5. Pipetear la solución de anticuerpos/PBS en el tubo. Enjuague los tubos con 0,25 ml de PBS adicional y transfiera al tubo.
  6. Asegure la parte superior del tubo lo más cerca posible de la solución con un clip de diálisis naranja.
  7. Pegue la parte superior del tubo en la parte superior exterior de un vaso de precipitados 4L. Deje que la parte llena del tubo cuelgue en el vaso de precipitados. Llene el vaso de precipitados con PBS y agregue una barra de agitación.
  8. Revuelva durante la noche durante 8 horas a 4oC.
  9. Sustituya el PBS en el vaso de precipitados por PBS fresco y revuelva durante 8 horas dos veces más.
  10. Transfiera el anticuerpo del tubo a tubos cónicos de 15 o 50 ml. Centrifugar durante 5 minutos a 1200 RPM para eliminar cualquier precipitado que pueda haberse formado. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo.
  11. Diluir una alícuota de anticuerpos 1:20 con PBS (anticuerpo de 5 l + PBS de 95 l). Cantidad de la concentración de anticuerpos con un espectrofotómetro (en blanco con PBS) a 280 nm. Utilice un coeficiente de extinción de 1,43. La concentración se calcula como

  12. Alícuota el anticuerpo en viales de tapa de tornillo y guárdelo a -80oC.

Los anticuerpos son una poderosa herramienta para la investigación y el diagnóstico, lo que significa que a menudo es necesario producirlos en grandes cantidades.

El primer paso para generar anticuerpos es inyectar el antígeno de interés en un animal huésped. El antígeno activa las células B del huésped que luego producen y liberan anticuerpos específicos de ese antígeno. A continuación, se realiza un cribado regular de los antisueros del animal huésped para detectar la presencia del anticuerpo diana, utilizando ELISA u otro método de detección. Una vez detectado, se extrae el bazo del animal huésped, que contiene las células B. Si todas las células B del bazo están ahora aisladas, esto debería incluir una población que segrega anticuerpos contra el antígeno de interés. Nos referimos a esta población como policlonal, porque cada célula probablemente ligada a un epítopo diferente del antígeno, y por lo tanto, generó su propio anticuerpo individual y único.

Para generar anticuerpos monoclonales, los anticuerpos elevados para reconocer un epítopo específico, la célula B individual que produce el anticuerpo deseado primero debe aislarse y cultivarse. Desafortunadamente, las células B no sobreviven bien en el cultivo. Así que para superar este obstáculo, los científicos fusionan las células B con células de mieloma inmortales, lo que resulta en hibridatos. Estas células se cultivan en un medio selectivo que sólo permite que los hibridatos crezcan y liberen anticuerpos. Una vez más, el medio se examinan utilizando un método como ELISA para el anticuerpo deseado. Una vez detectados, los hibriomas se clonan a través de un proceso llamado dilución limitante, una dilución en serie del cultivo padre, que debería dar lugar a que las células individuales se salpiquen en los pozos de una placa de cribado. Esto permite el crecimiento de hibridatos a partir de una sola célula madre, produciendo una línea celular monoclonal que sólo libera el anticuerpo deseado. Estas líneas monoclonales se pueden expandir en frascos de cultivo de tejido para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales. Después de esto, a medida que las células comienzan a morir, los anticuerpos se pueden precipitar desde el medio con sulfato de amonio. Normalmente, en solución, los anticuerpos interactúan con el agua a través de interacciones hidrófilas. Sin embargo, el amonio y el sulfato son iones altamente cargados que separan las moléculas de agua de los anticuerpos, disminuyendo la solubilidad de los anticuerpos y haciendo que se precipiten.

Para empezar, primero compruebe la lista de materiales y prepare todos los medios, suministros y superficies de trabajo para el protocolo.

Luego, encienda un baño de agua y colóquelo en 37 grados Centígrados. A continuación, agregue 10 mililitros de RPMI completo a un tubo cónico de 15 mililitros y 15 mililitros de RPMI completo a un matraz de cultivo celular T75 y déjalos a un lado. Con precaución y usando el equipo de protección personal adecuado, retire el vial congelado que contiene células de hybridoma del almacenamiento de nitrógeno líquido. Para liberar la presión dentro del vial, afloje ligeramente la tapa. Ahora, incubar cuidadosamente el vial en el baño de agua, asegurándose de que la tapa permanece por encima de la superficie del agua para minimizar las posibilidades de contaminación. Cuando las células estén casi desconadas, que normalmente toma alrededor de dos minutos, mueva el vial a la capucha del cultivo de tejido.

A continuación, limpie el exterior del vial con 70% de etanol antes de retirar la tapa. Con una pipeta estéril, transfiera las células al tubo cónico que contiene 10 mililitros de medio RPMI completo. Luego, centrifugar el tubo durante cinco minutos a 1200 RPM. Después de la centrifugación, mueva el tubo de nuevo a la capucha de tejido y limpie el exterior del tubo con etanol. Sin molestar el pellet, deseche el sobrenadante y luego agregue cinco mililitros de medio RPMI completo fresco y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender. A continuación, transfiera las células al matraz de cultivo celular T75 y coloque el matraz dentro de una incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados. Permita que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, que generalmente toma alrededor de tres días. Observe que las células de hybridoma no son adherentes y crecerán suspendidas en el medio. El tiempo para alcanzar suficiente confluencia puede variar en función del número inicial de células vivas y el tipo de célula de hibribio utilizado.

Una vez que las células sean lo suficientemente confluentes, utilice una pipeta estéril de 25 mililitros para transferirlas desde el matraz de cultivo a un tubo centrífugo cónico. Reventar las células por centrifugación a 1200 RPM durante cinco minutos. Mientras que las células están en la centrífuga, agregue 18 mililitros de RPMI completo en cada uno de los tres nuevos matraces de cultivo celular T75 y deje estos a un lado. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular en seis mililitros de RPMI completo. A continuación, agregue dos mililitros de la suspensión celular en cada uno de los tres nuevos matraces de cultivo celular. Finalmente, coloque los matraces en una incubadora establecida en 5% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius e incubar hasta que los matraces sean alrededor del 80% de confluentes, aproximadamente tres días.

En este punto, las células están listas para continuar su crecimiento en el medio libre de suero diseñado para líneas celulares de hibrido, como el medio líquido basal HB disponible comercialmente que contiene el suplemento HB101. Transfiera las células de cada matraz de cultivo celular a tubos cónicos de centrífuga y luego peletizar las células por centrifugación a 1200 RPM durante cinco minutos. Ahora, agregue 230 mililitros de medio libre de suero HB101 complementado en cada uno de los seis matraces de cultivo celular de 225 centímetros cuadrados y déjalos a un lado. Una centrifugación completa, retire el sobrenadante y resuspenda cada pellet en 10 mililitros de medio HB101 suplementario. Luego, en cada matraz de cultivo celular, agregue cinco mililitros de la suspensión celular. Coloque los matraces en la incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados Centígrados y continúe cultivando las células durante unas tres semanas. Durante este tiempo, las células producirán y liberarán el anticuerpo monoclonal de interés en el medio de cultivo y el anticuerpo estará listo para la purificación cuando las células comiencen a morir.

Para eliminar los desechos celulares de los medios de cultivo que contienen anticuerpos, vierta el contenido de los matraces de cultivo en tubos para un rotor de ángulo fijo. Coloque los tubos en el rotor y asegúrese de que esté nado correctamente antes de la centrifugación. Gire los tubos a 10.000 RPM durante ocho minutos. Mientras las muestras son centrifugadoras, coloque un vaso de precipitados de plástico de dos litros con una barra de agitación en un cubo de hielo y luego coloque el cubo de hielo en un plato de agitación.

A continuación, coloque una tapa de filtro de 500 mililitros en una botella de un litro. Conecte esta unidad de filtro superior a una casa utilizando el tubo adecuado. A continuación, vierta el sobrenadante que contiene el anticuerpo en la parte superior del filtro. Centrifugar el medio restante para separar los desechos celulares del sobrenadante que contiene anticuerpos. Cuando la parte superior del filtro esté llena de sobrenadant, inicie el vacío. Luego, cuando la botella de recolección de un litro esté casi llena, retire la tapa del filtro y vierta el sobrenadante filtrado en el vaso de precipitados de dos litros sobre hielo. Repita los pasos de filtración hasta que se procese todo el sobrenadante.

Cuando toda la muestra haya sido procesada, pese 295 gramos de sulfato de amonio por cada litro de sobrenadante filtrado. Comience la placa de agitación y agregue lentamente el sulfato de amonio al sobrenadante durante las próximas horas. Esto evita una alta concentración localizada de sal de sulfato de amonio que puede hacer precipitar proteínas no deseadas. Una vez que se haya añadido todo el sulfato de amonio, cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y muévalo, junto con la placa de agitación, a una cámara fría a cuatro grados centígrados y póngalo para agitar la solución de anticuerpos durante la noche.

A la mañana siguiente, vierta la solución de anticuerpos que contiene sulfato de amonio del vaso de precipitados de dos litros en tubos limpios para el rotor de ángulo fijo. Centrifugar los tubos a 6500 RPM durante 20 minutos sin romper para peletizar el anticuerpo en la parte inferior de los tubos. A continuación, aspirar el sobrenadante, usando precaución para no chupar el pellet suave. Continúe utilizando el mismo conjunto de tubos para recoger el anticuerpo peletado del resto del sobrenadante que contiene sulfato de amonio. Después de la última aspiración, vuelva a suspender cada pellet de anticuerpos en aproximadamente un mililitro de PBS.

Para eliminar el sulfato de amonio de la solución de anticuerpos, primero corte aproximadamente una pulgada de tubo de diálisis para cada mililitro de solución de anticuerpos. A continuación, limpie el tubo con agua destilada y ate un nudo en un extremo del tubo. Llene el tubo con agua destilada para comprobar si hay fugas del nudo. Si no hay fugas después de unos minutos, vacíe el agua del tubo.

A continuación, pipetear la solución de anticuerpos en el tubo. Para recuperar tantos anticuerpos como sea posible, enjuague los tubos con 0,25 mililitros adicionales de PBS y transfiera esto también al tubo. Asegure la parte superior del tubo lo más cerca posible de la solución con un clip de diálisis. Luego, pegue la parte superior del tubo en la parte superior exterior de un vaso de precipitados de cuatro litros con la parte llena del tubo colgando en el vaso de precipitados. Ahora, lleve el vaso de precipitados a la sala fría de cuatro grados Celsius y colóquelo en un plato de agitación. Llene el vaso de precipitados hasta la parte superior con PBS y agregue una barra de agitación. Deje que el tubo y la solución se revuelvan durante aproximadamente ocho horas. A la mañana siguiente, reemplace el PBS en el vaso de precipitados con PBS fresco y luego deje el vaso de precipitados para agitar de nuevo durante aproximadamente ocho horas. Más tarde esa noche, repita el proceso una última vez. Por la mañana, abra el tubo de diálisis y luego transfiera la solución de anticuerpos del tubo a tubos cónicos de 15 mililitros. Para eliminar cualquier precipitante que se haya formado durante la diálisis, centrifugar los tubos durante cinco minutos a 1200 RPM. Finalmente, transfiera el sobrenadante a tubos nuevos.

Para cuantificar la concentración de anticuerpos, primero haga una dilución de 20 veces añadiendo cinco microlitros de una alícuota de anticuerpos a 95 microlitros de PBS. A continuación, pipetear el anticuerpo diluido en una cubeta y utilizar un espectrofotómetro para registrar la concentración en 280 nanómetros. A continuación, calcule la concentración de anticuerpos utilizando la fórmula que se muestra. Por último, etiquete los viales de la tapa del tornillo con el nombre del anticuerpo, la concentración, la fecha de preparación y, si corresponde, el número de lote y el nombre del experimentador, y luego alíbe el anticuerpo en los viales de la tapa del tornillo etiquetados. Estos se pueden almacenar a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario.

Ejemplo de rendimientos utilizando la línea de hibrigoma 120G8 anti-ratón CD317 o PDCA-1 oscilaron entre 44 y 99,6 miligramos, que normalmente produce, en promedio, 67,3 miligramos de cantidad. Es importante tener en cuenta que cada ejecución de producción con la misma línea celular de hybridoma puede ser ligeramente diferente en la cantidad de anticuerpos monoclonales disponibles al final.

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