免疫蛍光顕微鏡:パラフィン埋め込組織切片の免疫蛍光染色

Immunology

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Concepts

ソース: トーマス・チャフィー1, トーマス・S・グリフィス2,3,4,キャサリン・L・シュヴェルトフェガー1,3,4
1ミネソタ大学ミネソタ大学研究室医学病理学科,ミネアポリス,MN 55455
2ミネソタ大学泌尿器科,ミネアポリス,MN 55455
3ミネソタ大学、ミネアポリス、MN 55455
4ミネソタ大学免疫学センター,ミネアポリス,MN 55455

組織切片の病理学的解析は、正常な組織構造のより良い理解を得るために使用することができ、疾患のメカニズムの理解に貢献することができます。組織生検は、患者または生体内モデルの実験から、ホルマリンまたはパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンワックスに埋め込むことによって保存されることが多い。これは長期貯蔵およびティッシュが切除されることを可能にする。組織はマイクロトームを使用して薄い(5 μm)セクションに切断され、セクションはガラススライドに付着している。組織セクションは抗体で染色することができ、組織セクション内の特定のタンパク質の検出を可能にします。蛍光色素(フルオロクロムとも呼ばれる)に結合した抗体を用いた染色は、レーザーによって励起されたときに特定の波長で発光する化合物であり、免疫蛍光として知られている。セクション内のタンパク質を検出する機能は、組織内の細胞型の不均一性、特定のシグナル伝達経路の活性化、バイオマーカーの発現などの情報を提供できます。使用される蛍煙素や分析に利用できる顕微鏡の種類に応じて、複数の色を使用することができ、ターゲットの多重分析が可能です。

以下のプロトコルは、パラフィン埋め込組織セクションの免疫蛍光染色に関与する基本的なステップを概説する。このプロトコルは、組織の固定、パラフィン埋め込みのプロセス、または組織の断面に関する詳細を含まないことに注意することが重要です。組織が切り分けされ、ガラススライド上に置かれると、それらは一連の等級のエタノール(EtOH)インキュベーションを通して再水和される。セクションは、組織セクションへの抗体の非特異的結合を減少させるためにブロッキング試薬でインキュベートされる。その後、セクションは、蛍舞体で直接標識されてもよいし、そうでないかもしれない一次抗体でインキュベートされる。一次抗体が直接標識されていない場合、セクションは、フッ素で標識された二次抗体でインキュベートされます。異なる抗体は、異なる染色条件を必要とし、したがって、抗体の最適化のための提案が含まれる。すべての結合されていない抗体を除去するために洗浄した後、スライドは、核を蛍光標識するためにDAPIを含む媒体で取り付けられる。取り付け媒体が乾燥したら、異なる蛍光色素を検出できるレーザーを使用してスライドを画像化できます。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 免疫 学. 免疫蛍光顕微鏡:パラフィン埋め込組織切片の免疫蛍光染色. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. セットアップ

  1. 一般的な染色プロトコルには、次の手順が含まれます。
    1. 一連の等級付けされたエタノールを使用してスライド上の組織セクションを再水和する。
    2. ブロッキングバッファーを用いて組織セクションをインキュベートすると、組織に対する抗体の非特異的結合をブロックし、バックグラウンド蛍光を減少させるのに役立ちます。
    3. ブロッキングバッファーを除去し、一次抗体中のセクションをインキュベートし、その時点で抗体はそのペプチド標的を結合する。
    4. 一次抗体を除去し、洗浄バッファー内のセクションを広範囲に洗浄する。
    5. 二次抗体でセクションをインキュベートして一次抗体への結合を可能にし、一次抗体がフッ素で直接標識されていない場合、二次抗体が必要とされる。
    6. 二次抗体をスライドから洗い流す。
    7. 取り付け媒体にスライドを取り付け、蛍光顕微鏡で可視化する前に乾燥させます。
  2. スライドホルダー(ガラスまたはプラスチック)、瓶、ピペット、パップペン、湿気のあるチャンバー、カバースリップ、DAPI付き取り付けメディアが必要です。
  3. キシレンはスライドの水分補給に使用される。キシレンは危険であり、手袋および実験室のコートを含む適切なPPEと一緒にヒュームフードで使用されるべきである。
  4. バッファー、ソリューション、試薬のレシピ
    1. グレードエタノール
      エタノール - 160 mL 200プルーフEtOHおよび40mL ddH2O
      エタノール - 140 mL 200プルーフEtOHおよび60mL ddH2O
    2. 抗原検索液
      10 mM ク硝酸ナトリウム、pH 6.0
    3. ブロックバッファ
      二次抗体を作った宿主動物から100 μL血清
      900 μL 1X PBS
      注:これは 10 セクションのボリュームです。必要に応じて、セクションあたり約 100 μL バッファの音量を調整します。
    4. 洗浄バッファ(1X PBS)

2. プロトコル

  1. キシレンとエタノールによる水分補給
    1. スライドをスライドホルダーに入れ、100%Xyleneアイソーマーソリューションにスライドを沈め、スライドが完全に溶液で覆われていることを確認します。
    2. 100%キシレンイソーマーのスライドを3分間インキュベートし、合計3回の別々のインキュベーションを2回繰り返します。汚染を最小限に抑えるために、新しい溶液に移す前に、スライドラックをペーパータオルで拭き取ってください。
      注:これらのインキュベーションは、3つの別々の容器で行う方が推奨されます。
    3. 100%EtOHでスライドを2分間インキュベートし、合計3回の別々のインキュベーションを2回繰り返します。
      注:これらのインキュベーションは、3つの別々の容器で行う方が推奨されます。
    4. 95%EtOHで2分間スライドをインキュベートします。
    5. 80% EtOH でスライドを 2 分間インキュベートします。
    6. 70% EtOH でスライドを 2 分間インキュベートします。
    7. 1X PBSでスライドを5分間インキュベートします。
  2. (オプション)一次抗体によって認識されるエピトープのマスク解除に対する抗原検索
    注1:この手順は、使用される抗体に大きく依存しており、抗原検索の要件を決定するために初期最適化手順を実行することをお勧めします。
    注2:この手順は、以下に示すF4/80染色では行わなかった。抗原検索の要件は、新しい抗体ごとに最適化する必要があります。
    1. 耐熱プラスチックまたはガラススライドホルダーにスライドを配置し、ラックがスライドで満たされていることを確認して、均等な熱分布を確保します。ラック内のスロットよりもサンプル数が少ない場合は、空のスライドを使用できます。
    2. ラックを2Lビーカーに1000mLの抗原アンマスキング溶液に入れ、10mLの抗原アンマスキングストックを990mLの水にします。
    3. 合計20分間電子レンジで、スライドが水で覆われたままであることを確認してください。
    4. ビーカーで20分間冷やします。
    5. ddH2Oを含むスライドホルダーにスライドラックを5分間洗います。毎回新鮮なddH2Oを使用して、合計3つの別々のインキュベーションのために2回繰り返します。スライドは各洗浄の間に同じスライドホルダーで洗うことができる。
    6. 1X PBSでスライドを5分間インキュベートします。
  3. パップペンでセクションをサークルします。これはティッシュセクションをカバーするために必要なバッファーの最低の容積の使用を可能にする。組織のセクションを乾燥させないようにしてください。
  4. 各セクションにブロック バッファを追加します。断面をカバーするために必要なバッファの量は、セクションのサイズによって異なりますが、25~500 μL の範囲である可能性があります。
    注:ブロッキングバッファーの選択は、使用される抗体によって異なる場合がある。例えば、二次抗体が上昇した宿主動物由来の10%血清は、二次抗体の非特異的結合を減少させるために使用されてもよい(例えば、正常なヤギ血清は、ヤギで二次抗体を上げた場合に使用することができる)。ブロッキングバッファーの最適化は、各一次抗体に対して行われるべきである。F4/80で乳腺腫瘍切片を染色するために、PBSで10%正常ヤギ血清の0.1mlを用いた。
  5. 室温または4°Cで1時間、または24時間まで加湿室内のブロッキングバッファーのセクションをインキュベートします。加湿された部屋はセクションが乾燥しないことを保障する。
  6. ブロッキング バッファをスライドから取り外して取り外します。あるいは、ブロッキングバッファはピペットを使用して除去することができますが、ピペット先端でセクションに触れないように注意してください。
  7. ブロッキングバッファー内の一次抗体を希釈する。
    注:抗体およびサンプルタイプごとに正しい希釈を決定する必要があります。最適化には、最適な染色を識別するために一連の希釈を行うことが含まれます。F4/80で乳腺腫瘍切片を染色するために、組織切片を0.1mLラット抗F4/80抗体で一晩4°Cでインキュベートし、PBSで1%正常ヤギ血清で1:100を希釈した。
  8. 各セクションに一次抗体を追加し、4°Cで最大16時間(一晩)加湿室でインキュベートします。一次抗体を使用せずにブロッキングバッファーに少なくとも1つのセクションを残して対照として機能し、二次抗体による非特異的結合を同定するのに役立つ。
  9. 一次抗体またはブロッキングバッファーをセクションから排出し、スライドラックにスライドを配置し、1x PBSのスライドホルダーに入れてPBSでセクションを洗浄します。毎回3回10分間洗います。
  10. ブロッキングバッファーで二次抗体1:200を希釈する。希釈は二次抗体に応じて最適化することができる。
  11. 二次抗体を対照を含むすべてのセクションに添加し、光から保護された加湿室で1時間インキュベートする。
  12. 二次抗体を切片から排出し、PBSで毎回3回洗浄する。
  13. DAPI を含む取り付けメディアをスライドに 2 ~3 滴追加し、サンプルにカバースリップを配置します。取り付け媒体が急速乾燥タイプのメディアでない場合は、漏れを防ぎ、サンプルを長期的に維持するために、溶融パラフィンワックスまたは爪磨きでスライドの端を密封する必要があります。
  14. スライドが暗闇の中で一晩乾燥し、蛍光顕微鏡を使用してセクションを画像化します。

3. データ分析と結果

  1. 染色されたセクションは、蛍光顕微鏡を用いて分析される。画像のキャプチャと解析の具体的な詳細は、顕微鏡の仕様と分析を実行するために使用されるソフトウェアに依存します。通常、画像は単一色の画像として撮影し、複数色の画像を生成するために重なり合うことができます。パーセント陽性細胞は、陽性染色された細胞の数をカウントし、セクション内のDAPI染色細胞の総数で除算することによって定量することができる。乳腺腫瘍セクションのF4/80染色については、ソフトウェアLeicaアプリケーションスイート、バージョン3.8を使用して、取得タブと画像オーバーレイ取得モードで、DAPIとRFPの両方が有効になりました。露出、ゲイン、ガンマは、実験によって異なりますが、DAPIの場合はそれぞれ20.0ミリ秒、1.0x、1.53、RFPでは944.2ms、1.0x、1.08と調整しました。[オーバーレイの取得] ボタンを使用して、DAPI および RFP 露出のオーバーレイ イメージを作成しました。
  2. 下の画像(図1)は、マクロファージおよび他の骨髄細胞上の抗原を検出するF4/80で染色された腫瘍部の免疫蛍光画像の例を示す。このセクションはDAPI含有の取り付け媒体を使用して取付けられ、核は青で示される。

細胞内のタンパク質の機能は、細胞内の適切な局在化に大きく依存します。免疫蛍光顕微鏡は、蛍光色素を用いて細胞内でタンパク質を可視化する方法である。蛍光色素は、励起と呼ばれるプロセスによって特定の波長で光エネルギーを吸収し、発光と呼ばれる異なる波長ですぐにエネルギーを放出する分子である蛍光色素です。

蛍光色素は、標的特異的抗体に結合し、免疫染色によって培養細胞または組織に導入される。この一次抗体が目的のタンパク質に結合すると、タンパク質は蛍光色素で標識されます。あるいは、蛍光色素は、一次抗体の代わりに二次抗体に共役することができ、二次抗体は、標的を標識するタンパク質一次抗体複合体に結合する。その後、サンプルは蛍光標識を保持するためにアンチフェード取り付け媒体で密封され、蛍光顕微鏡でイメージングする準備が整います。

蛍光顕微鏡には強力な光源が装備されています。光線は最初に励起フィルタを通過し、励起波長の光のみが通過します。励起光は、ダイクロイックミラーまたはビームスプリッタと呼ばれる特殊なミラーに到達し、対物レンズに向かって励起波長を選択的に反射するように設計されています。レンズは、サンプル内の小さな領域に光を焦点を当てます。サンプルに到達すると、光は蛍光素を励起し、異なる波長で光エネルギーを放出します。この光は、対物レンズを通してダイクロイックミラーに送り返されます。発光波長は励起波長と異なるので、ダイクロイックミラーは発光光を通過することができます。次に、発光フィルタと呼ばれる2番目のフィルタを通過し、存在する可能性のある他の波長から光を除去します。その後、光線はアイピースまたはカメラに到達し、特定の蛍光体から放出された光から作成された拡大画像を提示します。この画像は、細胞内の目的タンパク質の位置を表す。

DNA結合蛍光色素は、細胞内の基準点として核を標識する免疫染色と共にしばしば使用される。異なる励起放出波長を持つ複数の異なる蛍光色素は、同じサンプル内の異なるタンパク質に使用して、タンパク質の局在化を比較することができます。

このビデオは、組織サンプル中の目的のタンパク質の免疫蛍光染色の手順を示し、その後、蛍光顕微鏡でサンプルをイメージングする。

染色プロセスを開始する前に、埋め込みプロセス中に脱水されたセクションは、水分補給する必要があります。これを行うには、まずスライドをスライドホルダーに入れ、次に100%Xlene異体素でスライドを完全に水没させます。スライドが 3 分間インキュベートできるようにします。その後、容器からスライドを取り出し、ペーパータオルで余分なキシレンを拭き取り、さらに3分間、新鮮な容器に新しいキシレン浴に入れます。新鮮なキシレンを入れた新しい容器でこのインキュベーションを毎回繰り返し、ペーパータオルでスライドを拭き取ってから、新しい容器に移す前に、合計3回のインキュベーションを行います。次に、100%エタノールから2分間、一連の等級付きエタノール溶液でセクションをインキュベートします。スライドラックをペーパータオルで拭き取り、スライドを100%エタノールの新しい容器に移し、さらに2分間使用します。ペーパータオルで余分なエタノールを拭き取り、指定された時間のエタノールの指定濃度に従って、新しい浴場にスライドを移す洗浄のサイクルを続けます。最終的なエタノール洗浄の後、余分な溶液を振り落とし、5分間1X PBSでスライドをインキュベートします。

染色プロセスを開始するには、まず、PAP ペンでセクションを丸で囲み、バッファーがカバーする必要がある最小領域を識別します。スライド上のセクションが明確にマークされたら、各スライドに100マイクロリットルのブロッキングバッファを追加し、セクション表面全体をカバーするようにします。組織がブロッキングバッファーで覆われた後、加湿室にスライドを置きます。スライドをそのままにして室温で1時間インキュベートします。

目的のインキュベーション時間に従って、スライドから排出してブロッキングバッファを取り除きます。次に、ブロッキングバッファー内の一次抗体を希釈する。1:100希釈の場合、1.5ミリリットルの遠心管に990マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、続いて10マイクロリットルの一次抗体を同じチューブに追加します。1つのスライドにコントロールとしてラベルを付け、100マイクロリットルのブロッキングバッファを追加します。この対照は、二次抗体の任意の非特異的結合を同定するのに役立つ。次に、残りのスライドに100マイクロリットルの一次抗体バッファーを追加します。暗闇の中で、4度の摂氏で加湿室で一晩セクションをインキュベートします。

一晩インキュベーションに続いて、チャンバから切片を取り出し、各スライドおよびブロッキングバッファーから一次抗体を排出する。スライドをスライドラックに入れ、1X PBSでそれぞれ10分間3回洗います。スライドが1X PBSで洗浄している間、ブロッキングバッファーで二次抗体を希釈する。1:200希釈の場合、1.5ミリリットルチューブに995マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、続いて同じチューブに2次抗体の5マイクロリットルを追加します。コントロールを含むすべてのセクションに二次抗体を追加し、光から保護された加湿室で1時間インキュベートします。タイマーが鳴ったら、インキュベーターからスライドを取り外します。二次抗体を切り離します。二次抗体を取り除いたら、スライドをスライドラックに入れ、スライドを1X PBSで10分間完全に水没させ、光から保護します。この洗浄を3回繰り返し、各洗浄に新鮮な1X PBSを使用します。洗い流しの後、各スライドにDAPIを含む取り付けメディアを2~3滴追加し、サンプルにガラスカバースリップを配置します。蛍光スコープを使用してセクションをイメージングする前に、スライドを暗い場所で一晩乾燥させます。

イメージング中、画像キャプチャの詳細は、利用可能な特定の顕微鏡とソフトウェアに依存します。ただし、この特定の例では、ソフトウェアライカアプリケーションスイート、バージョン3。8は、分析を行うために使用される。このプログラムを使用して、[取得]タブとイメージオーバーレイ集録モードをクリックして、DAPIとRFPの両方を有効にします。次に、DAPI と RFP の両方の露出、ゲイン、およびガンマを調整し、ソフトウェアで定義された既定の設定を使用して初期設定を行い、露出時間とゲインを変更して明るさを最適化します。サンプルの画像飽和および光漂白を避けるために望ましい。ガンマは、画像の暗い領域を最適化するために変更できます。

設定を調整したら、[オーバーレイの取得] ボタンを押して、DAPI と RFP 露出のオーバーレイ イメージを作成します。この例画像は、実証された技術を用いて捕捉され、マウス乳腺腫瘍セクションを示し、抗原を検出する抗体F4/80で染色され、マクロファージおよび他の骨髄細胞上に赤色で描かれた。DAPI含有実装媒体を用いたので、核は青色で示される。イメージングからのデータは、組織セクション内のタンパク質の強度と局在化に関する情報を提供します。

例えば、F4/80で染色された腫瘍の画像では、この抗原の細胞表面染色が観察される。これらのデータはまた、組織セクション内の特定の細胞集団の頻度に関する情報を提供することができる。これは、正に染色された細胞の数を数え、ここでは赤色で示し、それを総細胞集団と比較し、青色で示し、以下の式を用いて周波数を計算することによって定量することができる。

Results

Figure 1
図1:乳腫瘍部のF4/80染色。固定後、マウス乳腺腫瘍を抗F4/80で切り分けて染色し、DAPI含有マウントメディアを用いて取り付けた。染色は、細胞表面F4/80染色によって赤色で示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

画像化から得られたデータは、組織セクション内のタンパク質の発現の強度および局在化に関する情報を提供する。調べられているタンパク質に応じて、これらのデータは、組織セクション内の特定の細胞集団の頻度に関する情報を提供することもできます。これは、正に染色された細胞の数をカウントし、総細胞集団と比較することによって定量することができます。

Applications and Summary

免疫蛍光は、組織セクションのコンテキスト内でタンパク質発現および局在化の調査を可能にする。この技術は、正常および疾患組織におけるタンパク質局在化または細胞数を調べることによって、組織が疾患の文脈でどのように変化するかを理解するために使用することができる。ローカリゼーションまたは式パターンの変更は、サンプルの特定の属性を決定してリンクできます。

References

  1. Im K, Mareninov S., Diaz MFP, Yong WH. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Yong W. (eds) Biobanking. Methods in Molecular Biology. 1897, Humana Press, New York, NY (2019)
  2. Ramos-Vara JA. Principles and Methods of Immunohistochemistry. Gautier JC. (eds) Drug Safety Evaluation. Methods in Molecular Biology. 1641, Humana Press, New York, NY (2017)
  3. Donaldson JG. Immunofluorescence Staining. Current protocols in Cell Biology. 69 (1):1 4.3.1-4.3.7. (2015)

1. セットアップ

  1. 一般的な染色プロトコルには、次の手順が含まれます。
    1. 一連の等級付けされたエタノールを使用してスライド上の組織セクションを再水和する。
    2. ブロッキングバッファーを用いて組織セクションをインキュベートすると、組織に対する抗体の非特異的結合をブロックし、バックグラウンド蛍光を減少させるのに役立ちます。
    3. ブロッキングバッファーを除去し、一次抗体中のセクションをインキュベートし、その時点で抗体はそのペプチド標的を結合する。
    4. 一次抗体を除去し、洗浄バッファー内のセクションを広範囲に洗浄する。
    5. 二次抗体でセクションをインキュベートして一次抗体への結合を可能にし、一次抗体がフッ素で直接標識されていない場合、二次抗体が必要とされる。
    6. 二次抗体をスライドから洗い流す。
    7. 取り付け媒体にスライドを取り付け、蛍光顕微鏡で可視化する前に乾燥させます。
  2. スライドホルダー(ガラスまたはプラスチック)、瓶、ピペット、パップペン、湿気のあるチャンバー、カバースリップ、DAPI付き取り付けメディアが必要です。
  3. キシレンはスライドの水分補給に使用される。キシレンは危険であり、手袋および実験室のコートを含む適切なPPEと一緒にヒュームフードで使用されるべきである。
  4. バッファー、ソリューション、試薬のレシピ
    1. グレードエタノール
      エタノール - 160 mL 200プルーフEtOHおよび40mL ddH2O
      エタノール - 140 mL 200プルーフEtOHおよび60mL ddH2O
    2. 抗原検索液
      10 mM ク硝酸ナトリウム、pH 6.0
    3. ブロックバッファ
      二次抗体を作った宿主動物から100 μL血清
      900 μL 1X PBS
      注:これは 10 セクションのボリュームです。必要に応じて、セクションあたり約 100 μL バッファの音量を調整します。
    4. 洗浄バッファ(1X PBS)

2. プロトコル

  1. キシレンとエタノールによる水分補給
    1. スライドをスライドホルダーに入れ、100%Xyleneアイソーマーソリューションにスライドを沈め、スライドが完全に溶液で覆われていることを確認します。
    2. 100%キシレンイソーマーのスライドを3分間インキュベートし、合計3回の別々のインキュベーションを2回繰り返します。汚染を最小限に抑えるために、新しい溶液に移す前に、スライドラックをペーパータオルで拭き取ってください。
      注:これらのインキュベーションは、3つの別々の容器で行う方が推奨されます。
    3. 100%EtOHでスライドを2分間インキュベートし、合計3回の別々のインキュベーションを2回繰り返します。
      注:これらのインキュベーションは、3つの別々の容器で行う方が推奨されます。
    4. 95%EtOHで2分間スライドをインキュベートします。
    5. 80% EtOH でスライドを 2 分間インキュベートします。
    6. 70% EtOH でスライドを 2 分間インキュベートします。
    7. 1X PBSでスライドを5分間インキュベートします。
  2. (オプション)一次抗体によって認識されるエピトープのマスク解除に対する抗原検索
    注1:この手順は、使用される抗体に大きく依存しており、抗原検索の要件を決定するために初期最適化手順を実行することをお勧めします。
    注2:この手順は、以下に示すF4/80染色では行わなかった。抗原検索の要件は、新しい抗体ごとに最適化する必要があります。
    1. 耐熱プラスチックまたはガラススライドホルダーにスライドを配置し、ラックがスライドで満たされていることを確認して、均等な熱分布を確保します。ラック内のスロットよりもサンプル数が少ない場合は、空のスライドを使用できます。
    2. ラックを2Lビーカーに1000mLの抗原アンマスキング溶液に入れ、10mLの抗原アンマスキングストックを990mLの水にします。
    3. 合計20分間電子レンジで、スライドが水で覆われたままであることを確認してください。
    4. ビーカーで20分間冷やします。
    5. ddH2Oを含むスライドホルダーにスライドラックを5分間洗います。毎回新鮮なddH2Oを使用して、合計3つの別々のインキュベーションのために2回繰り返します。スライドは各洗浄の間に同じスライドホルダーで洗うことができる。
    6. 1X PBSでスライドを5分間インキュベートします。
  3. パップペンでセクションをサークルします。これはティッシュセクションをカバーするために必要なバッファーの最低の容積の使用を可能にする。組織のセクションを乾燥させないようにしてください。
  4. 各セクションにブロック バッファを追加します。断面をカバーするために必要なバッファの量は、セクションのサイズによって異なりますが、25~500 μL の範囲である可能性があります。
    注:ブロッキングバッファーの選択は、使用される抗体によって異なる場合がある。例えば、二次抗体が上昇した宿主動物由来の10%血清は、二次抗体の非特異的結合を減少させるために使用されてもよい(例えば、正常なヤギ血清は、ヤギで二次抗体を上げた場合に使用することができる)。ブロッキングバッファーの最適化は、各一次抗体に対して行われるべきである。F4/80で乳腺腫瘍切片を染色するために、PBSで10%正常ヤギ血清の0.1mlを用いた。
  5. 室温または4°Cで1時間、または24時間まで加湿室内のブロッキングバッファーのセクションをインキュベートします。加湿された部屋はセクションが乾燥しないことを保障する。
  6. ブロッキング バッファをスライドから取り外して取り外します。あるいは、ブロッキングバッファはピペットを使用して除去することができますが、ピペット先端でセクションに触れないように注意してください。
  7. ブロッキングバッファー内の一次抗体を希釈する。
    注:抗体およびサンプルタイプごとに正しい希釈を決定する必要があります。最適化には、最適な染色を識別するために一連の希釈を行うことが含まれます。F4/80で乳腺腫瘍切片を染色するために、組織切片を0.1mLラット抗F4/80抗体で一晩4°Cでインキュベートし、PBSで1%正常ヤギ血清で1:100を希釈した。
  8. 各セクションに一次抗体を追加し、4°Cで最大16時間(一晩)加湿室でインキュベートします。一次抗体を使用せずにブロッキングバッファーに少なくとも1つのセクションを残して対照として機能し、二次抗体による非特異的結合を同定するのに役立つ。
  9. 一次抗体またはブロッキングバッファーをセクションから排出し、スライドラックにスライドを配置し、1x PBSのスライドホルダーに入れてPBSでセクションを洗浄します。毎回3回10分間洗います。
  10. ブロッキングバッファーで二次抗体1:200を希釈する。希釈は二次抗体に応じて最適化することができる。
  11. 二次抗体を対照を含むすべてのセクションに添加し、光から保護された加湿室で1時間インキュベートする。
  12. 二次抗体を切片から排出し、PBSで毎回3回洗浄する。
  13. DAPI を含む取り付けメディアをスライドに 2 ~3 滴追加し、サンプルにカバースリップを配置します。取り付け媒体が急速乾燥タイプのメディアでない場合は、漏れを防ぎ、サンプルを長期的に維持するために、溶融パラフィンワックスまたは爪磨きでスライドの端を密封する必要があります。
  14. スライドが暗闇の中で一晩乾燥し、蛍光顕微鏡を使用してセクションを画像化します。

3. データ分析と結果

  1. 染色されたセクションは、蛍光顕微鏡を用いて分析される。画像のキャプチャと解析の具体的な詳細は、顕微鏡の仕様と分析を実行するために使用されるソフトウェアに依存します。通常、画像は単一色の画像として撮影し、複数色の画像を生成するために重なり合うことができます。パーセント陽性細胞は、陽性染色された細胞の数をカウントし、セクション内のDAPI染色細胞の総数で除算することによって定量することができる。乳腺腫瘍セクションのF4/80染色については、ソフトウェアLeicaアプリケーションスイート、バージョン3.8を使用して、取得タブと画像オーバーレイ取得モードで、DAPIとRFPの両方が有効になりました。露出、ゲイン、ガンマは、実験によって異なりますが、DAPIの場合はそれぞれ20.0ミリ秒、1.0x、1.53、RFPでは944.2ms、1.0x、1.08と調整しました。[オーバーレイの取得] ボタンを使用して、DAPI および RFP 露出のオーバーレイ イメージを作成しました。
  2. 下の画像(図1)は、マクロファージおよび他の骨髄細胞上の抗原を検出するF4/80で染色された腫瘍部の免疫蛍光画像の例を示す。このセクションはDAPI含有の取り付け媒体を使用して取付けられ、核は青で示される。

細胞内のタンパク質の機能は、細胞内の適切な局在化に大きく依存します。免疫蛍光顕微鏡は、蛍光色素を用いて細胞内でタンパク質を可視化する方法である。蛍光色素は、励起と呼ばれるプロセスによって特定の波長で光エネルギーを吸収し、発光と呼ばれる異なる波長ですぐにエネルギーを放出する分子である蛍光色素です。

蛍光色素は、標的特異的抗体に結合し、免疫染色によって培養細胞または組織に導入される。この一次抗体が目的のタンパク質に結合すると、タンパク質は蛍光色素で標識されます。あるいは、蛍光色素は、一次抗体の代わりに二次抗体に共役することができ、二次抗体は、標的を標識するタンパク質一次抗体複合体に結合する。その後、サンプルは蛍光標識を保持するためにアンチフェード取り付け媒体で密封され、蛍光顕微鏡でイメージングする準備が整います。

蛍光顕微鏡には強力な光源が装備されています。光線は最初に励起フィルタを通過し、励起波長の光のみが通過します。励起光は、ダイクロイックミラーまたはビームスプリッタと呼ばれる特殊なミラーに到達し、対物レンズに向かって励起波長を選択的に反射するように設計されています。レンズは、サンプル内の小さな領域に光を焦点を当てます。サンプルに到達すると、光は蛍光素を励起し、異なる波長で光エネルギーを放出します。この光は、対物レンズを通してダイクロイックミラーに送り返されます。発光波長は励起波長と異なるので、ダイクロイックミラーは発光光を通過することができます。次に、発光フィルタと呼ばれる2番目のフィルタを通過し、存在する可能性のある他の波長から光を除去します。その後、光線はアイピースまたはカメラに到達し、特定の蛍光体から放出された光から作成された拡大画像を提示します。この画像は、細胞内の目的タンパク質の位置を表す。

DNA結合蛍光色素は、細胞内の基準点として核を標識する免疫染色と共にしばしば使用される。異なる励起放出波長を持つ複数の異なる蛍光色素は、同じサンプル内の異なるタンパク質に使用して、タンパク質の局在化を比較することができます。

このビデオは、組織サンプル中の目的のタンパク質の免疫蛍光染色の手順を示し、その後、蛍光顕微鏡でサンプルをイメージングする。

染色プロセスを開始する前に、埋め込みプロセス中に脱水されたセクションは、水分補給する必要があります。これを行うには、まずスライドをスライドホルダーに入れ、次に100%Xlene異体素でスライドを完全に水没させます。スライドが 3 分間インキュベートできるようにします。その後、容器からスライドを取り出し、ペーパータオルで余分なキシレンを拭き取り、さらに3分間、新鮮な容器に新しいキシレン浴に入れます。新鮮なキシレンを入れた新しい容器でこのインキュベーションを毎回繰り返し、ペーパータオルでスライドを拭き取ってから、新しい容器に移す前に、合計3回のインキュベーションを行います。次に、100%エタノールから2分間、一連の等級付きエタノール溶液でセクションをインキュベートします。スライドラックをペーパータオルで拭き取り、スライドを100%エタノールの新しい容器に移し、さらに2分間使用します。ペーパータオルで余分なエタノールを拭き取り、指定された時間のエタノールの指定濃度に従って、新しい浴場にスライドを移す洗浄のサイクルを続けます。最終的なエタノール洗浄の後、余分な溶液を振り落とし、5分間1X PBSでスライドをインキュベートします。

染色プロセスを開始するには、まず、PAP ペンでセクションを丸で囲み、バッファーがカバーする必要がある最小領域を識別します。スライド上のセクションが明確にマークされたら、各スライドに100マイクロリットルのブロッキングバッファを追加し、セクション表面全体をカバーするようにします。組織がブロッキングバッファーで覆われた後、加湿室にスライドを置きます。スライドをそのままにして室温で1時間インキュベートします。

目的のインキュベーション時間に従って、スライドから排出してブロッキングバッファを取り除きます。次に、ブロッキングバッファー内の一次抗体を希釈する。1:100希釈の場合、1.5ミリリットルの遠心管に990マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、続いて10マイクロリットルの一次抗体を同じチューブに追加します。1つのスライドにコントロールとしてラベルを付け、100マイクロリットルのブロッキングバッファを追加します。この対照は、二次抗体の任意の非特異的結合を同定するのに役立つ。次に、残りのスライドに100マイクロリットルの一次抗体バッファーを追加します。暗闇の中で、4度の摂氏で加湿室で一晩セクションをインキュベートします。

一晩インキュベーションに続いて、チャンバから切片を取り出し、各スライドおよびブロッキングバッファーから一次抗体を排出する。スライドをスライドラックに入れ、1X PBSでそれぞれ10分間3回洗います。スライドが1X PBSで洗浄している間、ブロッキングバッファーで二次抗体を希釈する。1:200希釈の場合、1.5ミリリットルチューブに995マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加し、続いて同じチューブに2次抗体の5マイクロリットルを追加します。コントロールを含むすべてのセクションに二次抗体を追加し、光から保護された加湿室で1時間インキュベートします。タイマーが鳴ったら、インキュベーターからスライドを取り外します。二次抗体を切り離します。二次抗体を取り除いたら、スライドをスライドラックに入れ、スライドを1X PBSで10分間完全に水没させ、光から保護します。この洗浄を3回繰り返し、各洗浄に新鮮な1X PBSを使用します。洗い流しの後、各スライドにDAPIを含む取り付けメディアを2~3滴追加し、サンプルにガラスカバースリップを配置します。蛍光スコープを使用してセクションをイメージングする前に、スライドを暗い場所で一晩乾燥させます。

イメージング中、画像キャプチャの詳細は、利用可能な特定の顕微鏡とソフトウェアに依存します。ただし、この特定の例では、ソフトウェアライカアプリケーションスイート、バージョン3。8は、分析を行うために使用される。このプログラムを使用して、[取得]タブとイメージオーバーレイ集録モードをクリックして、DAPIとRFPの両方を有効にします。次に、DAPI と RFP の両方の露出、ゲイン、およびガンマを調整し、ソフトウェアで定義された既定の設定を使用して初期設定を行い、露出時間とゲインを変更して明るさを最適化します。サンプルの画像飽和および光漂白を避けるために望ましい。ガンマは、画像の暗い領域を最適化するために変更できます。

設定を調整したら、[オーバーレイの取得] ボタンを押して、DAPI と RFP 露出のオーバーレイ イメージを作成します。この例画像は、実証された技術を用いて捕捉され、マウス乳腺腫瘍セクションを示し、抗原を検出する抗体F4/80で染色され、マクロファージおよび他の骨髄細胞上に赤色で描かれた。DAPI含有実装媒体を用いたので、核は青色で示される。イメージングからのデータは、組織セクション内のタンパク質の強度と局在化に関する情報を提供します。

例えば、F4/80で染色された腫瘍の画像では、この抗原の細胞表面染色が観察される。これらのデータはまた、組織セクション内の特定の細胞集団の頻度に関する情報を提供することができる。これは、正に染色された細胞の数を数え、ここでは赤色で示し、それを総細胞集団と比較し、青色で示し、以下の式を用いて周波数を計算することによって定量することができる。

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