純粋な培養物と縞めっき:混合サンプルからの単一細菌コロニーの単一の分離

Microbiology

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Concepts

ソース: ティルデ・アンダーソン1, ロルフ・ルード1
1臨床科学ルンド, 感染医学の部門, ルンド大学生物医学センター, 221 00 ルンド, スウェーデン

微生物の生物多様性を特定することは不可能に見えるが、推定1兆種の共存種(1,2)と本当に驚異的である。特に過酷な気候は、ヒト胃の酸性環境(3)または南極の氷河湖(4)のような、特定の種によって支配されてもよいが、細菌は典型的に混合培養に見出される。各株は、別の(5)の成長に影響を与える可能性があるため、コロニーを分離し、栽培する能力(1つのタイプのみで構成される)コロニーは、同様に臨床および学術的な設定で不可欠となっています。純粋な培養は、さらなる遺伝的(6)およびプロテオミクス検査(7)、サンプル純度の分析、およびおそらくより注目すべき、臨床サンプルからの感染剤の同定および特徴付けを可能にする。

細菌は、成長要件の広い範囲を持っており、要求の厳しい種と断固たる種(8)の両方を維持するように設計された栄養培地の多くの種類があります。成長培地は、液体形態(スープとして)または典型的な寒天系(赤藻類由来のゲル化剤)固体形態のいずれかで調製することができる。スープへの直接接種は、遺伝的に多様な、あるいは混合細菌集団を生成するリスクを伴うのに対し、めっきと再ストリークは、各細胞が非常に類似した遺伝的構成を有する純粋な文化を作成します。ストリークプレート技術は、サンプルの進行性希釈に基づいており(図1)、個々の細胞を互いに分離することを目的としています。培養物および指定環境によって持続される任意の生存細胞(以下、コロニー形成部、CFUと称される)は、その後、バイナリ核分裂を介して娘細胞の単離コロニーを見出すことができる。細菌群内の急速な突然変異率にもかかわらず、この細胞群は一般的にクローンとみなされている。その結果、この集団を収穫し、再ストリークすることで、その後の作業は1つの細菌タイプのみを含むことが保証されます。

Figure 1
図1:ストリークプレートは、元のサンプルの進行性希釈に基づいています。I)接種液は、最初はジグザグ運動を用いて分散し、比較的密な細菌集団を持つ領域を作成する。II-IV)ストリークは、4番目の象限に達するまで、毎回無菌接種ループを使用して、前の領域から引き出されます。V)プレートの中央に向かう最終的なジグザグ運動は、接種が著しく希釈された領域を形成し、コロニーが互いに別々に現れることを可能にする。

ストリークプレート技術は、選択的および/または差動媒体の使用と組み合わせることもできます。選択的培地は特定の生物の増殖を阻害する(例えば、抗生物質の添加を通じて)、微分培地は単に別のものと区別するのに役立ちます(例えば、血液寒天プレートの血化を通じて)。

微生物学のすべての仕事の根底にあるのは無菌(無菌)技術の使用である。危険な菌株の意図しない成長、エアロゾル形成、機器/人員の汚染のリスクがあるので、すべての細菌培養物は潜在的に病原性と見なされるべきです。これらのリスクを最小限に抑えるために、すべてのメディア、プラスチック、金属、ガラス製品は、通常、使用前後のオートクレーブによって殺菌され、残留細胞を効果的に拭き取る121°C付近の高圧飽和蒸気にさらされます。ワークスペースは、一般に、使用前および使用後の両方のエタノールを使用して消毒されます。ラボのコートと手袋は、常に感染性薬剤との作業中に着用されます。

Cite this Video

JoVE Science Education Database. 微生物 学. 純粋な培養物と縞めっき:混合サンプルからの単一細菌コロニーの単一の分離. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. 設定

  1. すべての微生物は、それらが危険であるかのように扱われるべきです。常にラボのコートと手袋を着用し、長い髪を結び、傷が特によく保護されていることを確認してください。
  2. 70%エタノールを使用して殺菌して作業スペースを準備します。
  3. 寒天プレート、サンプル溶液、および殺菌前のプラスチック接種ループまたは金属ループとブンゼンの炎の箱が近くにあることを確認します。使い捨て可能な、プラスチックループは通常前殺菌される。金属ループは70%エタノールに浸し、ブンセン炎の青い領域の近くに保持し、熱くなるまで加熱する必要があります。プレートの蓋を上げて(汚染を防ぐためにわずかに)、固化媒体に対してそれをタップして、ワイヤーを冷却することができます。
  4. 作業スペースの繰り返し殺菌と手と手首の徹底的な洗浄/殺菌で各手順を終了します。

2. プロトコル

  1. メディアの準備
    1. 利用される細菌種/株を維持する固体培地(通常は1.5%(w/v)寒天を含む固体培地を同定し、調べます。オートクレーブ時のオーバーフローを避けるために、最終ボリュームの2倍を保持することができるボトルに媒体を混ぜます。
    2. ボトルを半締め付けしたキャップで、オートクレーブに20分間121°Cに設定して、メディアを殺菌します。
    3. ボトルがオートクレーブから取り外されるとすぐにキャップを正しく閉じます。メディアをすぐに使用する場合は、ボトルを45°Cに設定した水風呂に入れ、液体状態に保ちます。寒天はそれ以外の場合は32〜40°C未満で固化し、後で85°Cの融点に再加熱(通常は電子レンジを使用)することができます。
  2. 培養プレートの調製
    1. 滅菌ペトリ皿(通常は100 x 15 mm)のベースを、実験者の名前、日付、メディアタイプで側面または下部にマークします。
    2. 45°C寒天培養培地(以前に調製)の20〜25 mLをラベル付きプレートのそれぞれに注ぎます。泡がエッジに沿って表示される場合は、これは迅速に通常のピペットと無菌先端を使用して除去する必要があります。
    3. 直ちにすべての蓋を皿の上に戻し、汚染を防ぎます。
    4. 寒天を室温で約2時間、または4°Cで一晩固化させます。一度設定すると、細菌培養プレートは、中表面の結露を最小限に抑えるために、4°Cで逆さまに保存する必要があります。
  3. ストリークメッキ
    1. 生殖不能ループを目的の接種液に沈め、ジグザグ運動を用いて採取したサンプルをプレートの最初の象限に直ちに分散させる(図1、I)。
    2. ふたを閉じ、接種ループを再殺菌するか、新しい生殖不能の使い捨てループを集める。
    3. プレートの第2象限に向かって第1象限(比較的密度の高い細菌集団を含む)から放射する3~4ストロークを作ります(図1、II)。
    4. 蓋を閉じて接種ループを再殺菌するか、使い捨てループを廃棄し、新しい滅菌ループを回収します。
    5. 第2象限から第3象限に3-4ストロークのこのストリークを繰り返し、次に3番目から4番目の象限に、毎回無菌ループを使用します(図1、III - IV)。
    6. 滅菌ループを使用して、プレートの中央に向かって4番目の象限からジグザグパターンで1つの最終ストロークを行います(図1、V)。細菌の有病率は、この領域では低く、理想的には個々のコロニーを単一の生存可能な母細胞から確立することを可能にする。
    7. 蓋を閉じ、(細菌種によって必要な場合)空気の流れを防ぐためにパラフィルムでシール。
    8. 細菌種/株に応じて、培養プレートを適切な環境に上下に置き、細菌のコロニーが見えるまでインキュベートします(分離されたコロニーは、初期濃度が変化する可能性があるため、プレートのどちらの領域にも現れることがあります)。
    9. クローン細菌集団を生成するために、別のプレートをストリークアウトし、元のプレートの単一のコロニーから単離した細胞に対してメッキされた接種を元のプレートに交換する。

ペトリ皿では、単一の細菌が無性生殖の複数のラウンドを受ける場合、それはクローンコロニーの形成につながります。しかしながら、土壌懸濁液などの混合試料から単一の細菌を得ることは困難であり得る。この異種培養物のループを1つ取れば、1兆個もの個々の細菌を含むことができる。この多くの細菌を寒天プレートの表面に広げ、単一のコロニーを得るためには、ジグザグパターンを使用しても、ループはリバティ島全体を囲むために並んで設定された十分なプレートの表面上に連続的にドラッグする必要があります。明らかに、科学者は実際にそれほど多くのプレートを使用していません。代わりに、彼らはストリークメッキと呼ばれる技術を使用しています。

ストリークプレート技術は、細菌サンプルの進行性希釈に基づいており、単一のペトリ皿の固体媒体表面上で行われます。まず、メディアサーフェスは、円周の 4 つの断片を最初の 4 つのセクションとして割り当て、プレートの中心を 5 番目のセクションとして割り当てることによって、5 つのセクションに視覚的に分割されます。これにより、1 つのペトリ皿から 5 つのメディア プレートが効果的に作成されます。次に、所望の接種のループフルを使用して、最初のセクションはジグザグパターンを使用して縞状になる。その後、新しい使い捨てループが使用されるか、またはワイヤループの場合には、ブンセンバーナーで殺菌され、ワイヤーの長さに沿って赤くなるまで燃やします。この新しいループ、または炎殺菌ループの使用は、細菌の希釈を助ける残りの細菌細胞を除去する。ホットループは、最初のセクションを通ってドラッグされる前に数秒間空気中で冷却され、それぞれが2番目のセクションに細菌のほんの一部を運ぶ3〜4つの別々のラインを作成します。残りのセクションは、毎回無菌ループを使用して、同じ方法でストリークされ、前のストリークを1回通過します。

ストリークと殺菌のこのサイクルを使用して、すべての後続のセクションの細菌濃度を希釈し、最後のセクションが少数の個別に位置する細菌のみを含むようにする必要があります。インキュベーション時に、これらの離散細菌は、コロニー形成単位、またはCCFと呼ばれる娘細胞の単離されたクローンコロニーを生成するために増殖する。これらは、純粋な培養と呼ばれる単一の細菌タイプのみを含むことを保証するために、収穫し、再ストリークすることができます。混合細菌培養から単一のコロニーを単一のコロニーを分離するだけでなく、ストリークめっき技術は、培養特異的株を選択したり、細菌コロニー形態を決定したり、異なる細菌種を同定するためにも使用されます。このビデオでは、ストリークメッキ技術を介して混合細菌サンプル懸濁液から単一細菌コロニーを分離する方法を示します。

まず、ラボグローブとラボコートを着用してください。次に、70%エタノールを使用してワークスペースを殺菌します。次に、利用される細菌種または菌株を維持し、培地の準備を開始する適切な培地を選択する。ここでは、一般的なLB寒天は、予め処方された粉末媒体と7.5グラムの寒天の10グラムを計量することによって調製される。オーバーフローを避けるために、最終容積の2倍を保持することができるガラスボトルに計量された乾燥したコンポーネントを追加します。その後、ボトルに500ミリリットルの水を追加し、半しっかりとキャップします。ボトルを121°Cに設定したオートクレーブに20分間置いてメディアを殺菌します。完成後、耐熱手袋またはホットパッドを使用して機械からメディアを取り外し、ボトルキャップを直ちにねじってしっかりと閉じます。

同日中に使用する場合は、ボトルを約45°Cに加熱した水浴に入れ、メディアを液体状態に保ち、冷やします。あるいは、培地を室温のままにしておき、固体状態で保存することができる。必要に応じて、蓋をしてボトルを電子レンジで加熱してメディアを溶かし、45°Cの水浴を使用してメディアを冷却します。

次に、無菌ペトリ皿のスリーブを取り、永久的なマーカーで、調査官とメディア名だけでなく、日付でそれらをラベル付けします。次に、必要な量の培温を滅菌容器に移し、必要に応じて抗生物質またはその他の敏感成分を添加する。ここで、50ミリリットルの培媒体を100マイクロリットルのカナマイシンと混合し、1ミリリットル当たり25マイクログラムの最終濃度を有する。チューブを旋回して、メディア全体に追加されたコンポーネントの均等な分布を確保します。ゆっくりと、気泡形成を避けるために、各プレートに約45°Cの培養培地の20~25ミリリットルを注ぐ。泡や泡が現れた場合は、通常のピペットと無菌チップを使用して速やかに取り外します。その後、直ちにすべての蓋を交換して汚染を防ぎます。寒天を室温で少なくとも2時間または一晩固変させる。固着したら、培養プレートを4°Cで逆さまに保存し、媒体の表面の結露を最小限に抑えます。

選択した培養をストリークするには、まずきれいな培養プレートを取り、蓋を取り除きます。迅速に作業し、使い捨て可能な無菌ループを目的の接種に沈め、ジグザグ運動を使用してプレートの最初の象限上でループを直ちに綿棒に振ります。皿のふたを交換し、使用した接種ループを廃棄し、新しい無菌ループを選択します。新しいループを使用して、最初の象限から放射される元の綿棒線を横切る 3 ~ 4 ストロークを作成します。蓋をもう一度閉じ、ループを破棄します。新しいループを使用して、この操作をもう一度繰り返しますが、今回は 2 番目から 3 番目の象限に連動します。その後、再び新しいループで、プレートの第3セクションから4番目のセクションに別のストリークを行います。最後に、新鮮なループで、プレートの中心に向かって4番目の象限からジグザグパターンで最後のストロークを作ります。細菌の有病率は、この領域では低く、理想的には個々のコロニーを単一の生存可能な母細胞から確立することを可能にする。

プレート蓋を交換し、細菌種に適宜、空気の流れを防ぐためにパラフィルムでプレートを密封します。凝縮の滴りを防ぐために培養プレートを逆さまにし、成長に適した温度に置きます。ここでは、インキュベーターは摂氏37度に設定されています。細菌のコロニーが見えるまでプレートをインキュベートできるようにします。クローン細菌集団を生成するには、このプレートから1つの離散コロニーを選択します。さて、無菌ループで、ターゲットコロニーに触れ、前と同様に、新しいプレートの最初の象限でストリークを作ります。ループを交互に殺菌し、前に示したようにプレートの残りの象限をストリークし続け、中央にジグザグで終わる。プレートを閉じ、離散コロニーが形成されるまでインキュベートするためにそれを配置します。これらのコロニーが成長すると、彼らは通常、純粋なクローン株を表します。

最初のストリークプレートは、サンプルの純度に応じて、異なる細菌種または異なる遺伝的構成を持つ細胞から生じるコロニーを含んでいてもよい。すべてのユニットが共通の母細胞から派生する単一コロニーのその後の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一によって、第二のストリークプロシージャは、ブロスへのさらなる特徴付けまたは接種に適した比較的クローン細菌集団を生成する。

Results

最初のストリークプレートは、異なる遺伝的構成を持つ細胞に由来するコロニーを含むこともあれば、異なる細菌種からの(サンプル純度に応じて)コロニーを含んでいてもよい(図2A)。

すべてのユニットが共通の母細胞から派生する単一コロニーのその後の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の処置によって、第二のストリークプロシージャは、ブロスへのさらなる特徴付けまたは接種のために適した比較的クローン細菌集団を生成する(図 2B)。

Figure 2
図2:単一の人里離れたコロニーを単離して混合サンプルから純粋な培養物を生成することができる。A)単一の細菌細胞(CFU)の成長は、他の種および株のものから分離されたクローンコロニーを生成した。このCFUは、新しいプレートB)第2のプレートに続くストリーキングに使用され、細菌集団は初期CFUに由来する細胞のみで構成される。

Applications and Summary

純粋な細菌のコロニーを得て栽培する能力は、臨床および学術的な設定の両方で不可欠です。ストリークメッキは、共有CFUに由来する比較的クローン細胞集団の単離を可能にし、診断中または単離物の追加特性化のために特に関心を持つ可能性がある。サンプルは、適切な寒天ベースの栄養培地にストリークされ、コロニーが見えるまでインキュベートされます。孤立したコロニーは、その後収穫され、第二のプレートに再ストリークされます。

References

  1. The Human Microbiome Project C. Structure, Function and Diversity of the Healthy Human Microbiome. Nature. 486:207-214. (2012)
  2. Locey KJ, Lennon JT. Scaling laws predict global microbial diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (21) 5970-5975 (2016)
  3. Skouloubris S, Thiberge JM, Labigne A, De Reuse H. The Helicobacter pylori UreI protein is not involved in urease activity but is essential for bacterial survival in vivo. Infection and Immunity. 66:4517-21. (1998)
  4. Mikucki JA, Auken E, Tulaczyk S, Virginia RA, Schamper C, Sørensen KI, Doran PT, Dugan H, Foley N. Deep groundwater and potential subsurface habitats beneath an Antarctic dry valley. Nature Communications. 6:6831. (2015)
  5. Mullineaux-Sanders C, Suez J, Elinav E, Frankel G. Sieving through gut models of colonization resistance. Nature Microbiology. 3:132-140. (2018)
  6. Fournier PE, Drancourt M, Raoult D. Bacterial genome sequencing and its use in infectious diseases. Lancet Infectious Diseases. 7:711-23 (2007)
  7. Yao Z, Li W, Lin Y, Wu Q, Yu F, Lin W, Lin X. Proteomic Analysis Reveals That Metabolic Flows Affect the Susceptibility of Aeromonas hydrophila to Antibiotics. Scientific Reports. 6:39413 (2016)
  8. Medina D, Walke JB, Gajewski Z, Becker MH, Swartwout MC, Belden LK. Culture Media and Individual Hosts Affect the Recovery of Culturable Bacterial Diversity from Amphibian Skin. Frontiers in Microbiology. 8:1574 (2017)

1. 設定

  1. すべての微生物は、それらが危険であるかのように扱われるべきです。常にラボのコートと手袋を着用し、長い髪を結び、傷が特によく保護されていることを確認してください。
  2. 70%エタノールを使用して殺菌して作業スペースを準備します。
  3. 寒天プレート、サンプル溶液、および殺菌前のプラスチック接種ループまたは金属ループとブンゼンの炎の箱が近くにあることを確認します。使い捨て可能な、プラスチックループは通常前殺菌される。金属ループは70%エタノールに浸し、ブンセン炎の青い領域の近くに保持し、熱くなるまで加熱する必要があります。プレートの蓋を上げて(汚染を防ぐためにわずかに)、固化媒体に対してそれをタップして、ワイヤーを冷却することができます。
  4. 作業スペースの繰り返し殺菌と手と手首の徹底的な洗浄/殺菌で各手順を終了します。

2. プロトコル

  1. メディアの準備
    1. 利用される細菌種/株を維持する固体培地(通常は1.5%(w/v)寒天を含む固体培地を同定し、調べます。オートクレーブ時のオーバーフローを避けるために、最終ボリュームの2倍を保持することができるボトルに媒体を混ぜます。
    2. ボトルを半締め付けしたキャップで、オートクレーブに20分間121°Cに設定して、メディアを殺菌します。
    3. ボトルがオートクレーブから取り外されるとすぐにキャップを正しく閉じます。メディアをすぐに使用する場合は、ボトルを45°Cに設定した水風呂に入れ、液体状態に保ちます。寒天はそれ以外の場合は32〜40°C未満で固化し、後で85°Cの融点に再加熱(通常は電子レンジを使用)することができます。
  2. 培養プレートの調製
    1. 滅菌ペトリ皿(通常は100 x 15 mm)のベースを、実験者の名前、日付、メディアタイプで側面または下部にマークします。
    2. 45°C寒天培養培地(以前に調製)の20〜25 mLをラベル付きプレートのそれぞれに注ぎます。泡がエッジに沿って表示される場合は、これは迅速に通常のピペットと無菌先端を使用して除去する必要があります。
    3. 直ちにすべての蓋を皿の上に戻し、汚染を防ぎます。
    4. 寒天を室温で約2時間、または4°Cで一晩固化させます。一度設定すると、細菌培養プレートは、中表面の結露を最小限に抑えるために、4°Cで逆さまに保存する必要があります。
  3. ストリークメッキ
    1. 生殖不能ループを目的の接種液に沈め、ジグザグ運動を用いて採取したサンプルをプレートの最初の象限に直ちに分散させる(図1、I)。
    2. ふたを閉じ、接種ループを再殺菌するか、新しい生殖不能の使い捨てループを集める。
    3. プレートの第2象限に向かって第1象限(比較的密度の高い細菌集団を含む)から放射する3~4ストロークを作ります(図1、II)。
    4. 蓋を閉じて接種ループを再殺菌するか、使い捨てループを廃棄し、新しい滅菌ループを回収します。
    5. 第2象限から第3象限に3-4ストロークのこのストリークを繰り返し、次に3番目から4番目の象限に、毎回無菌ループを使用します(図1、III - IV)。
    6. 滅菌ループを使用して、プレートの中央に向かって4番目の象限からジグザグパターンで1つの最終ストロークを行います(図1、V)。細菌の有病率は、この領域では低く、理想的には個々のコロニーを単一の生存可能な母細胞から確立することを可能にする。
    7. 蓋を閉じ、(細菌種によって必要な場合)空気の流れを防ぐためにパラフィルムでシール。
    8. 細菌種/株に応じて、培養プレートを適切な環境に上下に置き、細菌のコロニーが見えるまでインキュベートします(分離されたコロニーは、初期濃度が変化する可能性があるため、プレートのどちらの領域にも現れることがあります)。
    9. クローン細菌集団を生成するために、別のプレートをストリークアウトし、元のプレートの単一のコロニーから単離した細胞に対してメッキされた接種を元のプレートに交換する。

ペトリ皿では、単一の細菌が無性生殖の複数のラウンドを受ける場合、それはクローンコロニーの形成につながります。しかしながら、土壌懸濁液などの混合試料から単一の細菌を得ることは困難であり得る。この異種培養物のループを1つ取れば、1兆個もの個々の細菌を含むことができる。この多くの細菌を寒天プレートの表面に広げ、単一のコロニーを得るためには、ジグザグパターンを使用しても、ループはリバティ島全体を囲むために並んで設定された十分なプレートの表面上に連続的にドラッグする必要があります。明らかに、科学者は実際にそれほど多くのプレートを使用していません。代わりに、彼らはストリークメッキと呼ばれる技術を使用しています。

ストリークプレート技術は、細菌サンプルの進行性希釈に基づいており、単一のペトリ皿の固体媒体表面上で行われます。まず、メディアサーフェスは、円周の 4 つの断片を最初の 4 つのセクションとして割り当て、プレートの中心を 5 番目のセクションとして割り当てることによって、5 つのセクションに視覚的に分割されます。これにより、1 つのペトリ皿から 5 つのメディア プレートが効果的に作成されます。次に、所望の接種のループフルを使用して、最初のセクションはジグザグパターンを使用して縞状になる。その後、新しい使い捨てループが使用されるか、またはワイヤループの場合には、ブンセンバーナーで殺菌され、ワイヤーの長さに沿って赤くなるまで燃やします。この新しいループ、または炎殺菌ループの使用は、細菌の希釈を助ける残りの細菌細胞を除去する。ホットループは、最初のセクションを通ってドラッグされる前に数秒間空気中で冷却され、それぞれが2番目のセクションに細菌のほんの一部を運ぶ3〜4つの別々のラインを作成します。残りのセクションは、毎回無菌ループを使用して、同じ方法でストリークされ、前のストリークを1回通過します。

ストリークと殺菌のこのサイクルを使用して、すべての後続のセクションの細菌濃度を希釈し、最後のセクションが少数の個別に位置する細菌のみを含むようにする必要があります。インキュベーション時に、これらの離散細菌は、コロニー形成単位、またはCCFと呼ばれる娘細胞の単離されたクローンコロニーを生成するために増殖する。これらは、純粋な培養と呼ばれる単一の細菌タイプのみを含むことを保証するために、収穫し、再ストリークすることができます。混合細菌培養から単一のコロニーを単一のコロニーを分離するだけでなく、ストリークめっき技術は、培養特異的株を選択したり、細菌コロニー形態を決定したり、異なる細菌種を同定するためにも使用されます。このビデオでは、ストリークメッキ技術を介して混合細菌サンプル懸濁液から単一細菌コロニーを分離する方法を示します。

まず、ラボグローブとラボコートを着用してください。次に、70%エタノールを使用してワークスペースを殺菌します。次に、利用される細菌種または菌株を維持し、培地の準備を開始する適切な培地を選択する。ここでは、一般的なLB寒天は、予め処方された粉末媒体と7.5グラムの寒天の10グラムを計量することによって調製される。オーバーフローを避けるために、最終容積の2倍を保持することができるガラスボトルに計量された乾燥したコンポーネントを追加します。その後、ボトルに500ミリリットルの水を追加し、半しっかりとキャップします。ボトルを121°Cに設定したオートクレーブに20分間置いてメディアを殺菌します。完成後、耐熱手袋またはホットパッドを使用して機械からメディアを取り外し、ボトルキャップを直ちにねじってしっかりと閉じます。

同日中に使用する場合は、ボトルを約45°Cに加熱した水浴に入れ、メディアを液体状態に保ち、冷やします。あるいは、培地を室温のままにしておき、固体状態で保存することができる。必要に応じて、蓋をしてボトルを電子レンジで加熱してメディアを溶かし、45°Cの水浴を使用してメディアを冷却します。

次に、無菌ペトリ皿のスリーブを取り、永久的なマーカーで、調査官とメディア名だけでなく、日付でそれらをラベル付けします。次に、必要な量の培温を滅菌容器に移し、必要に応じて抗生物質またはその他の敏感成分を添加する。ここで、50ミリリットルの培媒体を100マイクロリットルのカナマイシンと混合し、1ミリリットル当たり25マイクログラムの最終濃度を有する。チューブを旋回して、メディア全体に追加されたコンポーネントの均等な分布を確保します。ゆっくりと、気泡形成を避けるために、各プレートに約45°Cの培養培地の20~25ミリリットルを注ぐ。泡や泡が現れた場合は、通常のピペットと無菌チップを使用して速やかに取り外します。その後、直ちにすべての蓋を交換して汚染を防ぎます。寒天を室温で少なくとも2時間または一晩固変させる。固着したら、培養プレートを4°Cで逆さまに保存し、媒体の表面の結露を最小限に抑えます。

選択した培養をストリークするには、まずきれいな培養プレートを取り、蓋を取り除きます。迅速に作業し、使い捨て可能な無菌ループを目的の接種に沈め、ジグザグ運動を使用してプレートの最初の象限上でループを直ちに綿棒に振ります。皿のふたを交換し、使用した接種ループを廃棄し、新しい無菌ループを選択します。新しいループを使用して、最初の象限から放射される元の綿棒線を横切る 3 ~ 4 ストロークを作成します。蓋をもう一度閉じ、ループを破棄します。新しいループを使用して、この操作をもう一度繰り返しますが、今回は 2 番目から 3 番目の象限に連動します。その後、再び新しいループで、プレートの第3セクションから4番目のセクションに別のストリークを行います。最後に、新鮮なループで、プレートの中心に向かって4番目の象限からジグザグパターンで最後のストロークを作ります。細菌の有病率は、この領域では低く、理想的には個々のコロニーを単一の生存可能な母細胞から確立することを可能にする。

プレート蓋を交換し、細菌種に適宜、空気の流れを防ぐためにパラフィルムでプレートを密封します。凝縮の滴りを防ぐために培養プレートを逆さまにし、成長に適した温度に置きます。ここでは、インキュベーターは摂氏37度に設定されています。細菌のコロニーが見えるまでプレートをインキュベートできるようにします。クローン細菌集団を生成するには、このプレートから1つの離散コロニーを選択します。さて、無菌ループで、ターゲットコロニーに触れ、前と同様に、新しいプレートの最初の象限でストリークを作ります。ループを交互に殺菌し、前に示したようにプレートの残りの象限をストリークし続け、中央にジグザグで終わる。プレートを閉じ、離散コロニーが形成されるまでインキュベートするためにそれを配置します。これらのコロニーが成長すると、彼らは通常、純粋なクローン株を表します。

最初のストリークプレートは、サンプルの純度に応じて、異なる細菌種または異なる遺伝的構成を持つ細胞から生じるコロニーを含んでいてもよい。すべてのユニットが共通の母細胞から派生する単一コロニーのその後の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一の単一によって、第二のストリークプロシージャは、ブロスへのさらなる特徴付けまたは接種に適した比較的クローン細菌集団を生成する。

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