プラークアッセイ:プラーク形成単位(PFU)としてウイルス定数を決定する方法

Microbiology

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Concepts

ソース: ティルデ・アンダーソン1, ロルフ・ルード1
1臨床科学ルンド, 感染医学の部門, ルンド大学生物医学センター, 221 00 ルンド, スウェーデン

バクテリオファージまたは単にファージと呼ばれる原核生物に感染するウイルスは、20世紀初頭にTwort(1)とデレル(2)によって独立して同定された。ファージは、その治療価値(3)とヒト(4)、ならびにグローバルな生態系(5)への影響について広く認識されています。現在の懸念は、感染症の治療における現代の抗生物質の代替としてファージの使用に新たな関心を高めています(6)。本質的にすべてのファージ研究は、ウイルスを精製し、ウイルス力を定量する能力に依存しています, また、ウイルス力中剤として知られています.最初に1952年に記載された、これはプラークアッセイ(7)の目的であった。数十年および複数の技術の進歩後、プラークアッセイは、ウイルス力付き(8)の決定のための最も信頼性の高い方法の一つである。

バクテリオファージは、宿主細胞に遺伝物質を注入し、新しいファージ粒子の製造のための機械を乗っ取り、最終的に細胞リシスを通じて多数の子孫を放出させることによって、生き残る。その微小な大きさのために、バクテリオファージは、単に光顕微鏡を使用して観察することはできません。そのため、走査型電子顕微鏡検査が必要です(図1)。さらに、ファージは、餌食に宿主細胞を必要とするので、細菌のような栄養寒天プレート上で栽培することはできません。

Figure 1
図1:バクテリオファージの形態は、ここで大腸菌ファージによって例示され、走査型電子顕微鏡を用いて研究することができる。ほとんどのバクテリオファージは、カウドビレア(尾のバクテリオファージ)に属しています。この特定のファージは、非常に短い尾構造とイコサヘドラルヘッドを有し、ポドウイルスのファミリーに置きます。

プラークアッセイ(図2)は、宿主細胞の組み込みに基づいており、優先的に対相増殖において、培地に。これは、ウイルスの成長を維持することができる細菌の密な、濁った層を作成します。単離されたファージは、その後感染し、内で複製し、1つの細胞をlyseすることができます。各細胞がlysed細胞で、複数の隣接する細胞が直ちに感染する。いくつかのサイクルで、クリアゾーン(プラーク)は、そうでなければ濁板(図2B/図3A)で観察することができ、最初に単一のバクテリオファージ粒子であったものの存在を示す。試料の体積当たりのプラーク形成単位数(すなわちPFU/mL)は、生成されるプラークの数から決定することができる。

Figure 2
図2:プラーク形成単位(PFU)の試験は、サンプル中のバクテリオファージの数を決定するための一般的な方法である。(A)滅菌ペトリ皿のベースは、適切な固体栄養培地で覆われ、続いて、ソフト培地、感受性宿主細胞および元のバクテリオファージサンプルの希釈が混合される。ファージ懸濁液は、場合によっては、既に固化した柔らかい寒天の表面全体に均等に広がる可能性があることに注意してください。(B)宿主細菌の増殖は、上寒天層に細胞の芝生を形成する。バクテリオファージ複製は、宿主細胞リシスによって引き起こされるクリアゾーン、またはプラークを生成します。

Figure 3
図3:PFU試験の結果は、バクテリオファージによって生成された複数のプラークを示す。感受性宿主細胞のリシスにより、プラークは(A)完全クリアランス、または(B)耐性細菌の生成によって引き起こされる部分的な再増殖(または場合には、または温帯ファージによって、リソジェニックサイクル)。

特定の温帯ファージは、以前に記載された溶解性成長に加えて、リソゲン性のライフサイクルと呼ばれるものを採用することができます。リソジェニーでは、ウイルスは、宿主細胞(9)のゲノムにその遺伝物質を取り込むことを通じて潜伏状態を仮定し、多くの場合、さらなるファージ感染に対する耐性を与える。これは時々プラークのわずかな曇りを通して明らかにされる(図3B)。しかし、以前のファージ感染とは無関係にファージに対する耐性を進化させた細菌の再増殖のためにプラークがぼやけて見えることも注目に値する。

ウイルスは、限られた範囲の宿主細菌にのみ付着または吸着することができる(10)。宿主範囲は、CRISPR-Casシステム(11)のような細胞内抗ウイルス戦略によってさらに制限される。細菌サブグループによって表示される特定のファージに対する耐性/感受性は、歴史的に異なるファージタイプに細菌株を分類するために使用されてきた(図4)。この方法の有効性は、新しいシーケンシング技術によって上回っていますが、ファージタイピングは、例えば、臨床使用のためのファージカクテルの設計を容易にする、細菌とファージの相互作用に関する貴重な情報を提供することができます.

Figure 4
図4:異なる細菌株のファージ感受性。キューチバクテリウム・ニキビ株(A)AD27および(B)AD35を有する柔らかい寒天板を、21種類のC.にきび細菌食症で発見した。唯一のファージ11は、株AD35がすべてのファージに対する感受性を示しながら、AD27に感染し、殺すことができました。ファージタイピングと呼なこの技術は、ファージ感受性に基づいて細菌種と株を異なるサブグループに分割するために使用することができる。

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JoVE Science Education Database. 微生物 学. プラークアッセイ:プラーク形成単位(PFU)としてウイルス定数を決定する方法. JoVE, Cambridge, MA, (2020).

Procedure

1. セットアップ

  1. 微生物を含む作業を開始する前に、作業スペースが殺菌されていることを確認してください(えば、70%のエタノールで拭き取ります)。常にラボのコートと手袋を着用し、長い髪を縛り付け、傷が特によく保護されていることを確認してください。
  2. 完成したら、すべての表面を殺菌し、手や手首を十分に洗浄/殺菌します。

2. プロトコル

  1. LB メディアの準備
    注:宿主細菌株およびバクテリオファージに応じて、異なる液体培地は、宿主細菌株または異なる固体培地の初期培養に対してより適してもよいし、その後の増殖に対してより適してもよい。リソジェニースープ(LB)は、スープと寒天のためにこのプロトコルで使用されます。
    1. 200 mL蒸留水に4g LBを混ぜ、三量三回に、LBスープ、固体底寒天、柔らかいトップ寒天を混ぜます。オートクレーブ中のオーバーフローを防ぐために、すべてのソリューションは、最終ボリュームの2倍を保持できる容器に用意する必要があります。
      注:三重にアッセイを行う場合は、LB底寒天の量を2倍に調べなさい。
    2. NaOH または HCl を必要に応じて、3 つのソリューションすべての pH を 7.4 に調整します。
    3. 底寒天ボトルに寒天の電力を3g加え、固体寒天の1.5%の寒天溶液を作る
    4. 上部の寒天ボトルに1.2gの寒天力を加え、柔らかい寒天の0.6%の寒天溶液を作ります。
    5. ボトルを半締め付けキャップ付きで、121°Cに設定したオートクレーブに20分間置き、溶液を殺菌します。汚染を防ぐために、実行が完了したらすぐにキャップを閉じます。
    6. LB培地が約45~50°Cの温度に達したら、200 mL LB溶液の3つすべてに450 μLの無菌1M CaCl2を加え、最終的な濃度を2.25mMにします。
    7. 固体寒天培地の15mLアリコットを無菌ペトリ皿に注ぎ(発泡を防ぐために揺れを避ける)、寒天が室温で数時間または一晩固まるようにします(図4A)。プレートは、数日間4°Cで逆さまに保存することができます。
  2. 宿主細胞の培養
    1. アッセイの1日前に、大腸菌培養の10μLをLBスープの10mLに加える。
    2. 振盪インキュベーターで160 rpmで一晩37°Cで細菌をインキュベートします。
    3. アッセイの朝、新鮮なLBの10mLに一晩培養の0.5mLを加える。
      注:三重にアッセイを行う場合は、この培養量の2倍を準備します。
    4. 細菌培養が対数相増殖になるまで、振盪インキュベーターで160rpmで37°Cでインキュベートします。これは0.5-0.7のOD600によって分光光度計で決定することができる。
    5. 細菌が上部LB寒天に追加されるまで、室温で培養してください。
  3. バクテリオファージの10倍のシリアル希釈
    1. LBスープの180μLを96ウェルプレートの最初の行の7つのウェルに追加
      注:その統計的信頼性を高めるために三量体で希釈を行うことが示唆される。これを行うには、プレートの2番目と3番目の行にバクテリオファージの追加の希釈を準備します。
    2. 元のバクテリオファージサンプルを慎重にボルテックスして均質性を確保し、20 μLを最初のウェルに移します。
    3. ピペッティングとダウンでサンプルをよく混ぜます。
    4. 得られた懸濁液の20μLを第2ウェルに移す。
    5. 第2井戸の溶液の20μLを第3ウェルに移してシリアル希釈を続け、6番目の井戸まで、ファージ懸濁液を加えない負の制御を残します。これにより、10-1 -1-10-6の希釈範囲が作成されます。
  4. めっき
    1. 名前、日付、短いサンプル説明(ファージサンプル希釈係数を含む)で、ペトリ皿のベース(以前はステップ2.1.7で調製)にラベルを付けます。ペトリ皿を37°Cのインキュベーターで予熱し、アッセイの1時間前に加熱します。
    2. 固化した柔らかい寒天媒体(通常は電子レンジを使用して行われ、固化寒天は85°Cで溶融)を溶かし、45°Cの周りに来るようにします。加熱された媒体は、適切な温度に達するために〜1時間の45°Cの水浴に置くことができます。それは液体の形で残るのに十分な熱いはずですが、追加された細菌を殺さないほど冷やします。
    3. 4 mL細菌培養(ステップ2.2から)を35 mL LB軟寒天(45°C)と混合します。細胞を均等に分配するために旋回するが、発泡を防ぐために揺れを避ける(図4A)。
    4. シリアル希釈ステップのそれぞれに対して1本の無菌試験管と、制御サンプル用に1本の無菌試験管をラベル付けし、合計7本の標識試験管にラベルを付けます。ステップ2.4.3から細菌培養/柔らかい寒天混合物の5 mLアリコートを7管に入れます。このような少量の寒天ベースのメディアは室温で素早く固まるため、ステップ2.4.6を通して迅速に作業します。
    5. 制御試料の100 μL(ステップ2.3から)をコントロール試験管に追加し、慎重に旋回します。使用したピペットチップを廃棄し、連続的に希釈されたバクテリオファージサンプル(ステップ2.3)のそれぞれから同じ体積をそれぞれの試験管に移し、混ぜ合わせます。
    6. 5 mL混合物をラベル付けされた、予熱された固体寒天プレートに直ちに移す(図4A)。プレートをそっと旋回して混合物を広げます。
      注:アッセイを三回転で実行する場合は、手順 2.4.3- 6 をもう 2 回繰り返します。
    7. 実験室用フィルムで各プレートをシールし、両方の層を室温(約15分)で適切に固化させてから、37°Cのインキュベーターを上下に置き、細菌とファージの両方の成長を刺激し、24時間またはプラークまでプラークが現れるのに通常約1〜5日かかりますが(図4B)、インキュベーション条件、培地、細菌種によってタイミングが大きく異なります。

3. データ分析と結果

  1. プラークのカウント
    1. これはウイルス汚染を示すので、「制御」とマークされたプレートにプラークが見えないことを確認してください。
    2. 最も希釈されたバクテリオファージサンプルを含む10-6のラベルのプレートから始めます。ふたを取り外さずにプラークを数え、ペンで印を付けて、どのプラークが既にカウントされているかを示します。
    3. 残りのプレートを数えます。一部のプレートには、数えるプラークが少なすぎたり多すぎたりすることがあります。さらなる分析のために10-150プラークとプレートを使用してください。
  2. PFU の計算
    1. プラークの数を希釈係数で除算し(最も希釈されたサンプルの場合は10-6)、ファージ混合物の100μLでプラーク形成単位(PFU)の数を得る。
      注:三量体でアッセイを行う場合は、3枚のプレートからプラークの平均数を使用します。
    2. 元のサンプルの濃度(PFU/mL)を決定するために、サンプルの100 μLのみがめっきされたので、10の追加の希釈係数を乗算します。(すなわち)
    3. より信頼性の高い結果を得るために、10~ 150 プラークの間にあるすべての希釈に対する PFU/mL の平均値を計算します。

ファルジとも呼ばれるバクテリオファージは、細菌に特異的に感染するウイルスであり、プラークアッセイと呼ばれるツールを使用してその存在を確認し、定量化することができます。バクテリオファージは、まず細菌細胞壁に付着し、その遺伝物質を注入することによって、その感受性宿主に感染する。その後、細胞の生合成機械を乗っ取ってDNAを複製し、多数の子孫ファージ粒子を産生し、宿主細胞を分解して死傷させる。

この溶解活性は、プラークアッセイまたは二重寒天層アッセイとして知られている広く使用されているファージ列挙技術の基礎である。ここで、バクテリオファージミックスは、まず低濃度寒天を含む溶融栄養スープで調製される。ミックスで使用されるすべての細菌は生きていて、積極的にその成長のログ段階で分割する必要があり、細菌の大部分が生存し、プラークの周りに密な芝生を形成できることを保証します。次に、この溶融細菌ファージ寒天ミックスは、ペトリ皿上で既に固化されている、より固体、濃縮寒天栄養培地の上に広がります。室温でのインキュベーションでは、低濃度の寒天菌のスープも固化し、柔らかい寒天のオーバーレイを形成します。

ここでは、細菌細胞は、底層から追加の栄養素を導き出ることができ、細菌のコンフルエント芝生を生成するために急速に増殖する必要があります。しかし、ファージ粒子も軟層に存在するにつれて、これらは細菌内で遺伝物質に感染して複製し、細胞リシスに至り、複数の子孫を放出する。これらのファージ子孫は、細菌ファージ層の半固体状態がより遠くに位置する宿主細胞にその動きを制限するように、隣接する細胞に感染する。感染とリシスのこのサイクルは、複数のラウンドにわたって継続し、局所的な領域で多数の細菌を殺します。破壊される隣接細胞の効果は、肉眼で見ることができるプラークと呼ばれる単一の円形クリアゾーンを生成し、効果的にファージの細菌の溶解活性を増幅し、その列挙を可能にすることです。

ペトリ皿上のプラークの数は、プラーク形成単位、またはPfUと呼ばれ、かつ、初期バクテリオファージ濃度を十分に希釈した場合、元の試料中の感染性ファージ粒子の数に直接対応する必要があります。この技術は、プラーク形態の特性形成、ファージ型の同定に役立つ、またはファージ変異体を単離するためにも使用することができる。このラボでは、大腸菌のT7ファージを例に、ファージを列挙するためのプラークアッセイを実行する方法を学びます。

まず、宿主細菌細胞およびバクテリオファージの培養に適した培地を同定する。ここでリソジェニーブロス、またはLB培地は、大腸菌およびT7ファージを培養するために用いた。次に、3本のきれいなガラス瓶を取り、メディア、名前、次にLB-Broth、2つ目はLB-Bottom寒天、3本目はLB-Top寒天としてラベルを付けます。さて、あらかじめ配合されたLB粉末を4グラムずつ計量し、1セットの計量乾燥培ったメディアを各ボトルに移します。最初のボトルに200ミリリットルの水を追加します。磁気攪拌バーを使用して内容物を混ぜます。

次に、pHメーターと一定撹拌を用いて、水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加することにより、最終的なpHを7.4にする。残りの2本のボトルについても、水の添加とpH調整を繰り返します。今、寒天粉末の3グラムの重量を量り、1.5%の底寒天を作るために2番目のボトルにそれを追加します。最後に、重量を量る 1.寒天の2グラムと.6%LBトップ寒天を作るために3番目のボトルにそれを追加します。ボトル1のスープの状態は寒天の添加を必要としません。ボトルを半き締めし、その後、20分間摂氏121度でオートクレーブによってメディアを殺菌します。完了したら、オートクレーブからメディアボトルを取り外し、すぐにボトルキャップをひねり、汚染を防ぐために完全に閉じます。LB-ブロスとLB-トップ寒天メディアをベンチに置いて、後で使用してください。LBボトム寒天を置き、約45°Cにあらかじめ設定された水浴で冷却します。

LB-Bottom 寒天が約45°Cに達したら、作業台に移します。次に、70%のエテノールを使用してワークスペースを殺菌します。次に、溶融底寒天に無菌1モル塩化カルシウムの450マイクロリットルを加え、最終的な濃度を2.25ミリモルにする。ボトルをそっと旋回して混ぜます。その後、7つのきれいなペトリ皿を設定します。下部の各料理に、メディア名と準備日にラベルを付けます。その後、底寒天の15ミリリットルを7つのペトリ皿のそれぞれに注ぎます。プレートを室温で数時間または一晩設定できるようにします。一度設定すると、培養プレートは、結露を最小限に抑えるために、必要に応じて数日間、4°Cで保存することができます。ペトリ皿を摂氏4度の冷蔵庫から37°Cのインキュベーターに1時間前に移します。

アッセイが事前に形成される前日には、大腸菌を培養する必要があります。ここで、大腸菌培養の10マイクロリットルをLB-ブロスの10ミリリットルに接種した。160 RPMで摂氏37度に設定された揺さぶるインキュベーターで一晩成長する細菌を置きます。次いで、アッセイの日に、インキュベーターから細菌培養を除去する。一晩培養の0.5ミリリットルで新鮮なLBスープの新鮮な10ミリリットルをシード。これらの細胞を160 RPMで摂氏37度に設定した揺れインキュベーターに成長させるために置きます。次に、分光光度計を使用して、このカルチャが対数相の成長に達した場合、0.5 ~ 0.7 の光学密度で示されます。ODがこのレベルに達したら、細胞培養をベンチに移すことによってインキュベーションを停止する。ファージオーバーレイアッセイに使用する準備が整いました。

ファージ価量は、異なるファージタイプとサンプルによって指数関数的に変化する可能性があります。したがって、それらを効果的に数えるために、彼らはファージ濃度の広い範囲を生成するために希釈する必要があります。アッセイの日に、10倍の希釈技術に従って、10分の1から100万分の1の濃度に及ぶ一連のファージ希釈を生成する。統計的に有意で正確なデータを取得するには、三逆でシリアル希釈を実行します。

次に、固化したLB-top寒天を電子レンジで溶かす。その後、1時間45°Cにあらかじめ設定された水浴に入れます。1時間後、インキュベーターから下部寒天層を含むペトリ皿を収集します。ファージ濃度とアッセイ日付でプレートにラベルを付けます。次に、7本のクリーン試験管を設置する。各試験管にシリアルファージ希釈番号をラベル付けし、1つをコントロールとして指定します。

LBトップ寒天が摂氏45度に達したら、作業ベンチに移します。さて、200ミリリットル寒天に塩化モルカルシウム1本の450マイクロリットルを加え、最終的な濃度を2.25ミリモルにします。ボトルをそっと旋回して混ぜます。次に、LBトップ寒天の35ミリリットルと無菌円錐管に細菌懸濁液の4ミリリットルを追加します。細胞を均等に分配するために穏やかに旋回するが、発泡を防ぐために揺れを避ける。

さて、この細菌のアリコート5ミリリットル- トップ寒天ミックス7つの試験管のそれぞれに。次に、連続的に希釈されたバクテリオファージサンプルおよびコントロールメディアの100マイクロリットルを、バクテリオファージを含む単に培地であるべきである、丁重に標識された試験管に移す。適切な混合を確実にするために、混合物を穏やかに旋回します。5ミリリットルのバクテリオファージミックスをそれぞれのペトリプレートにゆっくりと移します。ペトリプレートをそっと旋回して、表面全体に均等にミックスを広げます。

すべてのペトリプレートをミックスで重ねたら、室温で15分間インキュベートしてトップ層の固化を可能にする。これらのステップが完了した後、ファージ希釈の残りの2セットを使用して、ペトリ皿の第2と第3セットのプロセスを繰り返します。各皿をパラフィルムで密封し、室温で15分間インキュベートします。培養プレートを適切な温度で24時間、またはプラークが発達するまで逆さまに置きます。ここで、プレートを1日37°Cのインキュベーターに入れ、大腸菌及びT7ファージに対する刺激的な成長条件を有する。

プラークは、細菌種、インキュベーション条件、および培地の選択に応じて、インキュベーションの1〜5日後に現れる。ここでは、37°Cのインキュベーションの1日後にプラークが見えました。まず、マークされたコントロールのプレートをチェックし、ウイルス汚染を示すので、これらのプレートにプラークが形成されていないことを確認します。元のサンプルのファージ係数を決定するには、最初に最も希釈されたファージサンプルを含むプレートから始め、蓋を取り外さずにプラークを数え、既にカウントされているものを示すようにマークします。各セットの各プレートのカウントを繰り返します。一部のプレートには、数えるプラークが多すぎるか少なすぎる場合があります。理想的なプラーク数として 10 ~ 150 とします。

次に、異なる希釈および反復のプラーク番号値を一覧表示するテーブルを生成します。次に、理想的な数のプラーク数を含む希釈プレートの平均プラーク数値を計算する。この例では、これらは、10からマイナス3とマイナス4希釈プレートに形成されたプラークの平均数であった。さて、得られた平均プラーク値をそれぞれのファージ希釈因子で割ることによってファージ希釈係数を調整する。ここで、10からマイナス3及び10からマイナス4希釈プレートに形成されたプラークの平均数を、それぞれの希釈因子で割り、プラーク形成単位(PFU)の数を、ファージ混合物の100マイクロリットルで得た。値を1ミリリットル当たりPFUに変換するには、バクテリオファージオーバーレイ調製工程中に100マイクロリットルのファージ希釈ミックスのみが使用されたため、生成された値に10を掛け、10の追加希釈係数を生成しました。最後に、異なる希釈プレートから得られた値の平均を計算します。これにより、1 ミリリットルあたりの PFU の平均数が増加します。PFUの数は、元のサンプル中の感染性ファージ粒子の数に相当する。

Applications and Summary

複数の技術の進歩にもかかわらず、プラークアッセイはウイルス力確定のためのゴールドスタンダード(PFUとして)であり、純粋なバクテリオファージ集団の単離に不可欠です。感受性の高い宿主細胞は、2層寒天板のトップコートで培養され、ウイルス複製を可能にする均質なベッドを形成する。溶解ライフサイクル中の単離されたバクテリオファージが細胞に感染し、細胞内で複製し、最終的にそれを溶解する最初のイベントは、観察するには小さすぎます。しかし、放出されたビリオンは隣接する細胞に感染し、その後、単一のPFUの存在を示すクリアリングゾーン、またはプラークを生み出す。

References

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1. セットアップ

  1. 微生物を含む作業を開始する前に、作業スペースが殺菌されていることを確認してください(えば、70%のエタノールで拭き取ります)。常にラボのコートと手袋を着用し、長い髪を縛り付け、傷が特によく保護されていることを確認してください。
  2. 完成したら、すべての表面を殺菌し、手や手首を十分に洗浄/殺菌します。

2. プロトコル

  1. LB メディアの準備
    注:宿主細菌株およびバクテリオファージに応じて、異なる液体培地は、宿主細菌株または異なる固体培地の初期培養に対してより適してもよいし、その後の増殖に対してより適してもよい。リソジェニースープ(LB)は、スープと寒天のためにこのプロトコルで使用されます。
    1. 200 mL蒸留水に4g LBを混ぜ、三量三回に、LBスープ、固体底寒天、柔らかいトップ寒天を混ぜます。オートクレーブ中のオーバーフローを防ぐために、すべてのソリューションは、最終ボリュームの2倍を保持できる容器に用意する必要があります。
      注:三重にアッセイを行う場合は、LB底寒天の量を2倍に調べなさい。
    2. NaOH または HCl を必要に応じて、3 つのソリューションすべての pH を 7.4 に調整します。
    3. 底寒天ボトルに寒天の電力を3g加え、固体寒天の1.5%の寒天溶液を作る
    4. 上部の寒天ボトルに1.2gの寒天力を加え、柔らかい寒天の0.6%の寒天溶液を作ります。
    5. ボトルを半締め付けキャップ付きで、121°Cに設定したオートクレーブに20分間置き、溶液を殺菌します。汚染を防ぐために、実行が完了したらすぐにキャップを閉じます。
    6. LB培地が約45~50°Cの温度に達したら、200 mL LB溶液の3つすべてに450 μLの無菌1M CaCl2を加え、最終的な濃度を2.25mMにします。
    7. 固体寒天培地の15mLアリコットを無菌ペトリ皿に注ぎ(発泡を防ぐために揺れを避ける)、寒天が室温で数時間または一晩固まるようにします(図4A)。プレートは、数日間4°Cで逆さまに保存することができます。
  2. 宿主細胞の培養
    1. アッセイの1日前に、大腸菌培養の10μLをLBスープの10mLに加える。
    2. 振盪インキュベーターで160 rpmで一晩37°Cで細菌をインキュベートします。
    3. アッセイの朝、新鮮なLBの10mLに一晩培養の0.5mLを加える。
      注:三重にアッセイを行う場合は、この培養量の2倍を準備します。
    4. 細菌培養が対数相増殖になるまで、振盪インキュベーターで160rpmで37°Cでインキュベートします。これは0.5-0.7のOD600によって分光光度計で決定することができる。
    5. 細菌が上部LB寒天に追加されるまで、室温で培養してください。
  3. バクテリオファージの10倍のシリアル希釈
    1. LBスープの180μLを96ウェルプレートの最初の行の7つのウェルに追加
      注:その統計的信頼性を高めるために三量体で希釈を行うことが示唆される。これを行うには、プレートの2番目と3番目の行にバクテリオファージの追加の希釈を準備します。
    2. 元のバクテリオファージサンプルを慎重にボルテックスして均質性を確保し、20 μLを最初のウェルに移します。
    3. ピペッティングとダウンでサンプルをよく混ぜます。
    4. 得られた懸濁液の20μLを第2ウェルに移す。
    5. 第2井戸の溶液の20μLを第3ウェルに移してシリアル希釈を続け、6番目の井戸まで、ファージ懸濁液を加えない負の制御を残します。これにより、10-1 -1-10-6の希釈範囲が作成されます。
  4. めっき
    1. 名前、日付、短いサンプル説明(ファージサンプル希釈係数を含む)で、ペトリ皿のベース(以前はステップ2.1.7で調製)にラベルを付けます。ペトリ皿を37°Cのインキュベーターで予熱し、アッセイの1時間前に加熱します。
    2. 固化した柔らかい寒天媒体(通常は電子レンジを使用して行われ、固化寒天は85°Cで溶融)を溶かし、45°Cの周りに来るようにします。加熱された媒体は、適切な温度に達するために〜1時間の45°Cの水浴に置くことができます。それは液体の形で残るのに十分な熱いはずですが、追加された細菌を殺さないほど冷やします。
    3. 4 mL細菌培養(ステップ2.2から)を35 mL LB軟寒天(45°C)と混合します。細胞を均等に分配するために旋回するが、発泡を防ぐために揺れを避ける(図4A)。
    4. シリアル希釈ステップのそれぞれに対して1本の無菌試験管と、制御サンプル用に1本の無菌試験管をラベル付けし、合計7本の標識試験管にラベルを付けます。ステップ2.4.3から細菌培養/柔らかい寒天混合物の5 mLアリコートを7管に入れます。このような少量の寒天ベースのメディアは室温で素早く固まるため、ステップ2.4.6を通して迅速に作業します。
    5. 制御試料の100 μL(ステップ2.3から)をコントロール試験管に追加し、慎重に旋回します。使用したピペットチップを廃棄し、連続的に希釈されたバクテリオファージサンプル(ステップ2.3)のそれぞれから同じ体積をそれぞれの試験管に移し、混ぜ合わせます。
    6. 5 mL混合物をラベル付けされた、予熱された固体寒天プレートに直ちに移す(図4A)。プレートをそっと旋回して混合物を広げます。
      注:アッセイを三回転で実行する場合は、手順 2.4.3- 6 をもう 2 回繰り返します。
    7. 実験室用フィルムで各プレートをシールし、両方の層を室温(約15分)で適切に固化させてから、37°Cのインキュベーターを上下に置き、細菌とファージの両方の成長を刺激し、24時間またはプラークまでプラークが現れるのに通常約1〜5日かかりますが(図4B)、インキュベーション条件、培地、細菌種によってタイミングが大きく異なります。

3. データ分析と結果

  1. プラークのカウント
    1. これはウイルス汚染を示すので、「制御」とマークされたプレートにプラークが見えないことを確認してください。
    2. 最も希釈されたバクテリオファージサンプルを含む10-6のラベルのプレートから始めます。ふたを取り外さずにプラークを数え、ペンで印を付けて、どのプラークが既にカウントされているかを示します。
    3. 残りのプレートを数えます。一部のプレートには、数えるプラークが少なすぎたり多すぎたりすることがあります。さらなる分析のために10-150プラークとプレートを使用してください。
  2. PFU の計算
    1. プラークの数を希釈係数で除算し(最も希釈されたサンプルの場合は10-6)、ファージ混合物の100μLでプラーク形成単位(PFU)の数を得る。
      注:三量体でアッセイを行う場合は、3枚のプレートからプラークの平均数を使用します。
    2. 元のサンプルの濃度(PFU/mL)を決定するために、サンプルの100 μLのみがめっきされたので、10の追加の希釈係数を乗算します。(すなわち)
    3. より信頼性の高い結果を得るために、10~ 150 プラークの間にあるすべての希釈に対する PFU/mL の平均値を計算します。

ファルジとも呼ばれるバクテリオファージは、細菌に特異的に感染するウイルスであり、プラークアッセイと呼ばれるツールを使用してその存在を確認し、定量化することができます。バクテリオファージは、まず細菌細胞壁に付着し、その遺伝物質を注入することによって、その感受性宿主に感染する。その後、細胞の生合成機械を乗っ取ってDNAを複製し、多数の子孫ファージ粒子を産生し、宿主細胞を分解して死傷させる。

この溶解活性は、プラークアッセイまたは二重寒天層アッセイとして知られている広く使用されているファージ列挙技術の基礎である。ここで、バクテリオファージミックスは、まず低濃度寒天を含む溶融栄養スープで調製される。ミックスで使用されるすべての細菌は生きていて、積極的にその成長のログ段階で分割する必要があり、細菌の大部分が生存し、プラークの周りに密な芝生を形成できることを保証します。次に、この溶融細菌ファージ寒天ミックスは、ペトリ皿上で既に固化されている、より固体、濃縮寒天栄養培地の上に広がります。室温でのインキュベーションでは、低濃度の寒天菌のスープも固化し、柔らかい寒天のオーバーレイを形成します。

ここでは、細菌細胞は、底層から追加の栄養素を導き出ることができ、細菌のコンフルエント芝生を生成するために急速に増殖する必要があります。しかし、ファージ粒子も軟層に存在するにつれて、これらは細菌内で遺伝物質に感染して複製し、細胞リシスに至り、複数の子孫を放出する。これらのファージ子孫は、細菌ファージ層の半固体状態がより遠くに位置する宿主細胞にその動きを制限するように、隣接する細胞に感染する。感染とリシスのこのサイクルは、複数のラウンドにわたって継続し、局所的な領域で多数の細菌を殺します。破壊される隣接細胞の効果は、肉眼で見ることができるプラークと呼ばれる単一の円形クリアゾーンを生成し、効果的にファージの細菌の溶解活性を増幅し、その列挙を可能にすることです。

ペトリ皿上のプラークの数は、プラーク形成単位、またはPfUと呼ばれ、かつ、初期バクテリオファージ濃度を十分に希釈した場合、元の試料中の感染性ファージ粒子の数に直接対応する必要があります。この技術は、プラーク形態の特性形成、ファージ型の同定に役立つ、またはファージ変異体を単離するためにも使用することができる。このラボでは、大腸菌のT7ファージを例に、ファージを列挙するためのプラークアッセイを実行する方法を学びます。

まず、宿主細菌細胞およびバクテリオファージの培養に適した培地を同定する。ここでリソジェニーブロス、またはLB培地は、大腸菌およびT7ファージを培養するために用いた。次に、3本のきれいなガラス瓶を取り、メディア、名前、次にLB-Broth、2つ目はLB-Bottom寒天、3本目はLB-Top寒天としてラベルを付けます。さて、あらかじめ配合されたLB粉末を4グラムずつ計量し、1セットの計量乾燥培ったメディアを各ボトルに移します。最初のボトルに200ミリリットルの水を追加します。磁気攪拌バーを使用して内容物を混ぜます。

次に、pHメーターと一定撹拌を用いて、水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加することにより、最終的なpHを7.4にする。残りの2本のボトルについても、水の添加とpH調整を繰り返します。今、寒天粉末の3グラムの重量を量り、1.5%の底寒天を作るために2番目のボトルにそれを追加します。最後に、重量を量る 1.寒天の2グラムと.6%LBトップ寒天を作るために3番目のボトルにそれを追加します。ボトル1のスープの状態は寒天の添加を必要としません。ボトルを半き締めし、その後、20分間摂氏121度でオートクレーブによってメディアを殺菌します。完了したら、オートクレーブからメディアボトルを取り外し、すぐにボトルキャップをひねり、汚染を防ぐために完全に閉じます。LB-ブロスとLB-トップ寒天メディアをベンチに置いて、後で使用してください。LBボトム寒天を置き、約45°Cにあらかじめ設定された水浴で冷却します。

LB-Bottom 寒天が約45°Cに達したら、作業台に移します。次に、70%のエテノールを使用してワークスペースを殺菌します。次に、溶融底寒天に無菌1モル塩化カルシウムの450マイクロリットルを加え、最終的な濃度を2.25ミリモルにする。ボトルをそっと旋回して混ぜます。その後、7つのきれいなペトリ皿を設定します。下部の各料理に、メディア名と準備日にラベルを付けます。その後、底寒天の15ミリリットルを7つのペトリ皿のそれぞれに注ぎます。プレートを室温で数時間または一晩設定できるようにします。一度設定すると、培養プレートは、結露を最小限に抑えるために、必要に応じて数日間、4°Cで保存することができます。ペトリ皿を摂氏4度の冷蔵庫から37°Cのインキュベーターに1時間前に移します。

アッセイが事前に形成される前日には、大腸菌を培養する必要があります。ここで、大腸菌培養の10マイクロリットルをLB-ブロスの10ミリリットルに接種した。160 RPMで摂氏37度に設定された揺さぶるインキュベーターで一晩成長する細菌を置きます。次いで、アッセイの日に、インキュベーターから細菌培養を除去する。一晩培養の0.5ミリリットルで新鮮なLBスープの新鮮な10ミリリットルをシード。これらの細胞を160 RPMで摂氏37度に設定した揺れインキュベーターに成長させるために置きます。次に、分光光度計を使用して、このカルチャが対数相の成長に達した場合、0.5 ~ 0.7 の光学密度で示されます。ODがこのレベルに達したら、細胞培養をベンチに移すことによってインキュベーションを停止する。ファージオーバーレイアッセイに使用する準備が整いました。

ファージ価量は、異なるファージタイプとサンプルによって指数関数的に変化する可能性があります。したがって、それらを効果的に数えるために、彼らはファージ濃度の広い範囲を生成するために希釈する必要があります。アッセイの日に、10倍の希釈技術に従って、10分の1から100万分の1の濃度に及ぶ一連のファージ希釈を生成する。統計的に有意で正確なデータを取得するには、三逆でシリアル希釈を実行します。

次に、固化したLB-top寒天を電子レンジで溶かす。その後、1時間45°Cにあらかじめ設定された水浴に入れます。1時間後、インキュベーターから下部寒天層を含むペトリ皿を収集します。ファージ濃度とアッセイ日付でプレートにラベルを付けます。次に、7本のクリーン試験管を設置する。各試験管にシリアルファージ希釈番号をラベル付けし、1つをコントロールとして指定します。

LBトップ寒天が摂氏45度に達したら、作業ベンチに移します。さて、200ミリリットル寒天に塩化モルカルシウム1本の450マイクロリットルを加え、最終的な濃度を2.25ミリモルにします。ボトルをそっと旋回して混ぜます。次に、LBトップ寒天の35ミリリットルと無菌円錐管に細菌懸濁液の4ミリリットルを追加します。細胞を均等に分配するために穏やかに旋回するが、発泡を防ぐために揺れを避ける。

さて、この細菌のアリコート5ミリリットル- トップ寒天ミックス7つの試験管のそれぞれに。次に、連続的に希釈されたバクテリオファージサンプルおよびコントロールメディアの100マイクロリットルを、バクテリオファージを含む単に培地であるべきである、丁重に標識された試験管に移す。適切な混合を確実にするために、混合物を穏やかに旋回します。5ミリリットルのバクテリオファージミックスをそれぞれのペトリプレートにゆっくりと移します。ペトリプレートをそっと旋回して、表面全体に均等にミックスを広げます。

すべてのペトリプレートをミックスで重ねたら、室温で15分間インキュベートしてトップ層の固化を可能にする。これらのステップが完了した後、ファージ希釈の残りの2セットを使用して、ペトリ皿の第2と第3セットのプロセスを繰り返します。各皿をパラフィルムで密封し、室温で15分間インキュベートします。培養プレートを適切な温度で24時間、またはプラークが発達するまで逆さまに置きます。ここで、プレートを1日37°Cのインキュベーターに入れ、大腸菌及びT7ファージに対する刺激的な成長条件を有する。

プラークは、細菌種、インキュベーション条件、および培地の選択に応じて、インキュベーションの1〜5日後に現れる。ここでは、37°Cのインキュベーションの1日後にプラークが見えました。まず、マークされたコントロールのプレートをチェックし、ウイルス汚染を示すので、これらのプレートにプラークが形成されていないことを確認します。元のサンプルのファージ係数を決定するには、最初に最も希釈されたファージサンプルを含むプレートから始め、蓋を取り外さずにプラークを数え、既にカウントされているものを示すようにマークします。各セットの各プレートのカウントを繰り返します。一部のプレートには、数えるプラークが多すぎるか少なすぎる場合があります。理想的なプラーク数として 10 ~ 150 とします。

次に、異なる希釈および反復のプラーク番号値を一覧表示するテーブルを生成します。次に、理想的な数のプラーク数を含む希釈プレートの平均プラーク数値を計算する。この例では、これらは、10からマイナス3とマイナス4希釈プレートに形成されたプラークの平均数であった。さて、得られた平均プラーク値をそれぞれのファージ希釈因子で割ることによってファージ希釈係数を調整する。ここで、10からマイナス3及び10からマイナス4希釈プレートに形成されたプラークの平均数を、それぞれの希釈因子で割り、プラーク形成単位(PFU)の数を、ファージ混合物の100マイクロリットルで得た。値を1ミリリットル当たりPFUに変換するには、バクテリオファージオーバーレイ調製工程中に100マイクロリットルのファージ希釈ミックスのみが使用されたため、生成された値に10を掛け、10の追加希釈係数を生成しました。最後に、異なる希釈プレートから得られた値の平均を計算します。これにより、1 ミリリットルあたりの PFU の平均数が増加します。PFUの数は、元のサンプル中の感染性ファージ粒子の数に相当する。

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