Terwijl de eerste fase van glycolyse energie verbruikt om glucose om te zetten in glyceraldehyde 3-fosfaat (G3P), produceert de tweede fase energie. De energie wordt vrijgegeven via een reeks reacties die G3P in pyruvaat omzetten. De energie-oogstende fase – stappen 6-10 van de glycolyse – vindt twee keer plaats, één keer voor elk van de twee 3-koolstofsuikers die tijdens de stappen 1-5 worden geproduceerd.
De eerste stap van het vrijgeven van energie – ofwel de zesde stap van glycolyse – bestaat uit twee gelijktijdige gebeurtenissen: oxidatie en fosforylering van G3P. De elektronendrager NAD + verwijdert één waterstof uit G3P, oxideert de 3-koolstofsuiker en zet (reducerend) NAD + om in NADH en H + . De vrijgekomen energie wordt gebruikt om G3P te fosforyleren, waardoor het wordt omgezet in 1,3-bisfosfoglyceraat.
In de volgende stap zet 1,3-bisfosfoglyceraat ADP om in ATP door een fosfaatgroep te doneren, waardoor het in 3-fosfoglyceraat veranderd. Het 3-fosfoglyceraat wordt vervolgens omgezet in een isomeer, 2-fosfoglyceraat.
De 2-fosfoglyceraat verliest vervolgens een watermolecuul en verandert het in het onstabiele 2-fosfoenolpyruvaat of PEP molecuul. PEP geeft gemakkelijk zijn fosfaatgroep af aan ADP, waardoor een tweede ATP-molecuul en pyruvaat ontstaan.
De energie-oogstende fase maakt twee moleculen ATP en één molecuul NADH per omgezette suiker vrij. Omdat dit twee keer voorkomt – voor elke 3-koolstofsuiker die wordt geproduceerd in de energie-vereisende fase van de glycolyse – komen er in totaal vier ATP-moleculen en twee NADH-moleculen vrij. Aldus resulteert glycolyse voor elk glucosemolecuul in een nettoproductie van twee ATP-moleculen (4 geproduceerd minus 2 gebruikt tijdens de energie-vereisende fase) en twee NADH-moleculen.
Glycolyse zet één glucosemolecuul om in twee pyruvaatmoleculen, die elk uit 3 koolstofatomen bestaan. In de aanwezigheid van zuurstof kan pyruvaat worden afgebroken tot koolstofdioxide in de Krebs-cyclus, waarbij veel ATP-moleculen vrijkomen. NADH verzamelt zich in de cel, waar het weer omgezet kan worden naar NAD + en gebruikt kan worden voor verdere glycolyse.