Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.8: 체외 돌연변이유도
목차

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content.

Education
In-vitro Mutagenesis
 
스크립트

15.8: 체외 돌연변이유도

유전자의 기능에 대해 더 배우기 위해 과학자들은 유전적으로 조작된 유전자제거(knock-out; 넉아웃) 동물을 만들어 유전자가 활성화되지 않거나 “넉아웃”되었을 때 어떤 일이 일어나는지 관찰할 수 있습니다. 유전자제거 쥐는 특히 암, 파킨슨병, 그리고 당뇨병과 같은 인간 질병의 모델로 유용합니다.

과정

유전자는 무작위로 제거되거나 특정 유전자가 표적(target)이 될 수 있습니다. 특정 유전자를 없애려면 타겟팅 벡터(targeting vector)라고 불리는 유전자 조작된 DNA 조각을 사용해 정상 유전자를 대체해 해당 유전자를 비활성화합니다.

타겟팅 벡터는 각 말단에 관심 유전자(gene of interest)의 양쪽에 인접한 서열와 동일하거나 상동적(homologous)인 서열을 가지고 있습니다. 이러한 상동적 서열은 타겟팅 벡터가 상동재조합(homologous recombination)을 통해 관심 유전자를 대체할 수 있도록 합니다 (상동재조합은 감수분열(meiosis) 중 유사한 서열을 가진 DNA 사이에서 자연적으로 발생하는 과정입니다).

타겟팅 벡터는 배양 중인 쥐 배아 줄기세포(embryonic stem cell)에 전기천공법(electroporation; 전기 충격을 통해 세포막에 일시적으로 구멍을 만드는 것)과 같은 방법을 사용하여 도입됩니다. 일반적으로, 벡터가 유전자를 적절하게 대체한 세포를 식별하기 위해, 상동 영역 사이에 네오마이신(neomycin) 내성 유전자(NeoR)와 같은 양성 선택 표지자(positive selection marker)와 바이러스 티미딘인산화효소(viral thymidine kinase, 줄여서 TK)와 같은 음성 선택 표지자(negative selection marker)를 포함하도록 설계됩니다.

세포들은 네오마이신에 노출되고, DNA에 벡터를 통합한 세포만이 NeoR 유전자 때문에 살아남습니다. 또한, 벡터가 상동재조합을 통해 관심 유전자를 대체한 세포는 TK 유전자를 가지고 있지 않아 간시클로버(ganciclovir)에 노출되어도 생존합니다. 이때 간시클로버는 벡터가 유전체에 무작위로 삽입된 세포를 제거하는 데 사용됩니다. 그런 세포는 TK 유전자를 가지고 있기 때문입니다.

유전자가 적절하게 제거된 세포는 쥐 배아에 삽입되고, 쥐 배아는 암컷의 자궁에 착상되어 태어날 때까지 발달합니다. 그렇게 태어난 쥐는 키메라(chimera)로, 일부 세포는 배아에서 정상 DNA를 얻었고, 다른 세포는 유전자 조작된 세포에서 관심 유전자가 제거된 DNA를 얻은 상태입니다. 이 쥐를 번식 시켜 얻은 새끼 중 생식세포에 관심 유전자가 제거된 DNA를 포함하고 있는 새끼를 골라 교차번식을 통해 모든 세포가 제거된 유전자에 동형접합적(homozygous)인 쥐의 계통(line)을 만듭니다. 그러고 나서 이 유전자제거 쥐들을 유전자 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.


추천 독서

Tags

In-vitro Mutagenesis Knock Out Gene Targeting Vector Neomycin Resistance Thymidine Kinase Embryonic Stem Cells Homologous Recombination Positive Selection Marker Negative Selection Marker Knockout Mice Genetically Engineered Animals Human Diseases

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter