Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.8: Мутагенез in vitro
СОДЕРЖАНИЕ

JoVE Core
Biology

This content is Free Access.

Education
Мутагенез in vitro
 
Этот закадровый голос сгенерирован компьютером
ТРАНСКРИПТ
* Текстовый перевод сгенерирован компьютером

15.8: Мутагенез in vitro

Чтобы узнать больше о функции гена, исследователи могут наблюдать, что происходит, когда ген инактивирован или "выбит", создавая генетически модифицированных животных нокаутом. Нокаут мышей были особенно полезны в качестве моделей для человеческих заболеваний, таких как рак, болезнь Паркинсона, и диабет.

Процесс

Гены могут быть случайно выбиты, или конкретные гены могут быть направлены. Чтобы выбить определенный ген, инженерный кусок ДНК, называемый вектором таргетинга, используется для замены нормального гена, тем самым инактивируя его.

Векторы таргетинга имеют последовательности на каждом конце, идентичные или гомологичные, к последовательностям, фланговым каждой стороне гена интереса. Эти гомологичные последовательности позволяют вектору таргетинга заменить ген через гомологичную рекомбинацию – процесс, который естественным образом возникает между ДНК с аналогичными последовательностями во время мейоза.

Вектор таргетинга вводится в эмбриональные стволовые клетки мыши в культуре, используя такие методы, как электропорация – использование электрических импульсов для временного создания пор в клеточной мембране. Как правило, для идентификации клеток, в которых вектор правильно заменил ген, он предназначен для включения положительного маркера отбора, например гена устойчивости неомицина (NeoR)-между гомологичными регионами; и отрицательный маркер отбора, например, ген вирусной тимидинкиназы (ТК) — после одного из гомологизных регионов.

Клетки подвергаются воздействию неомицина, и только те, которые включили вектор в свою ДНК, выживут, потому что у них есть ген NeoR. Кроме того, клетки, где вектор заменил целевой ген через гомологичную рекомбинацию, не будут иметь гена ТЗ, что позволит им выжить при наличии препарата ганцикловир. Таким образом, воздействие ганцикловира используется для устранения клеток, которые вектор случайно вставляется в их геном, потому что эти клетки будут иметь ген ТЗ.

Клетки с геном правильно выбиты затем вставляются в эмбрион мыши, который имплантируется в матку самки, где она развивается до рождения. Полученная мышь является химерой, то есть состоит из смеси клеток , некоторые с нормальной ДНК из эмбриона, а некоторые с геном выбил на одной хромосоме из инженерии клеток. Эти мыши выведены, и потомство, содержащее ген в их зародышевой линии далее скрещивается, чтобы создать линию мышей, где каждая клетка гомозиготна для нокаута. Эти нокаут мышей могут быть использованы для изучения функции генов.


Литература для дополнительного чтения

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter