Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.8: In-vitro mutagenese
INHOUDSOPGAVE

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
In-vitro Mutagenesis
 
TRANSCRIPT

15.8: In-vitro Mutagenesis

15.8: In-vitro mutagenese

To learn more about the function of a gene, researchers can observe what happens when the gene is inactivated or “knocked out,” by creating genetically engineered knockout animals. Knockout mice have been particularly useful as models for human diseases such as cancer, Parkinson’s disease, and diabetes.

The Process

Genes can be randomly knocked out, or specific genes can be targeted. To knock out a particular gene, an engineered piece of DNA called a targeting vector is used to replace the normal gene, thereby inactivating it.

Targeting vectors have sequences on each end that are identical—or homologous— to the sequences flanking each side of the gene of interest. These homologous sequences allow the targeting vector to replace the gene through homologous recombination—a process that occurs naturally between DNA with similar sequences during meiosis.

The targeting vector is introduced into mouse embryonic stem cells in culture, using methods such as electroporation—use of electric pulses to temporarily create pores in the cell membrane. Typically, to identify cells where the vector has properly replaced the gene, it is designed to include a positive selection marker—such as the gene for neomycin resistance (NeoR)—between the homologous regions; and a negative selection marker—such as the gene for viral thymidine kinase (TK)—after one of the homologous regions.

The cells are exposed to neomycin, and only those that have incorporated the vector into their DNA will survive because they have the NeoR gene. Also, cells, where the vector has replaced the targeted gene through homologous recombination, will not have the TK gene, allowing them to survive in the presence of the drug ganciclovir. Therefore, exposure to ganciclovir is used to eliminate cells that have the vector randomly inserted into their genome, because these cells will have the TK gene.

The cells with the gene properly knocked out are then inserted into a mouse embryo, which is implanted into the uterus of a female, where it develops until birth. The resulting mouse is a chimera—meaning it is composed of a mixture of cells—some with normal DNA from the embryo, and some with the gene knocked out on one chromosome from the engineered cells. These mice are bred, and offspring containing the gene in their germline are further crossbred to create a line of mice where every cell is homozygous for the knockout. These knockout mice can then be used to study gene function.

Om meer te weten te komen over de functie van een gen, kunnen onderzoekers observeren wat er gebeurt als het gen wordt geïnactiveerd of "uitgeschakeld", door genetisch gemanipuleerde knock-outdieren te maken. Knock-out-muizen zijn bijzonder nuttig geweest als modellen voor ziekten bij de mens zoals kanker, de ziekte van Parkinson en diabetes.

Het proces

Genen kunnen willekeurig worden uitgeschakeld, of specifieke genen kunnen worden gericht. Om een bepaald gen uit te schakelen, wordt een gemanipuleerd stuk DNA, een targeting-vector genaamd, gebruikt om het normale gen te vervangen, waardoor het wordt geïnactiveerd.

Targeting-vectoren hebben sequenties aan elk uiteinde die identiek zijn - of homoloog - aan de sequenties die elke kant van het betreffende gen flankeren. Deze homologe sequenties stellen de doelgerichte vector in staat het gen te vervangen door homologe recombinatie - een proces dat van nature plaatsvindt tussen DNA met vergelijkbare sequenties tijdens meiose.

De richtende vector wordt geïntroduceerd in de embryonale stamcel van muizenls in cultuur, met behulp van methoden zoals elektroporatie - gebruik van elektrische pulsen om tijdelijk poriën in het celmembraan te creëren. Om cellen te identificeren waarin de vector het gen op de juiste manier heeft vervangen, is het ontworpen om een positieve selectiemarker - zoals het gen voor neomycineresistentie (Neo R ) - tussen de homologe gebieden op te nemen; en een negatieve selectiemarker - zoals het gen voor virale thymidinekinase (TK) - na een van de homologe regio's.

De cellen worden blootgesteld aan neomycine en alleen degenen die de vector in hun DNA hebben opgenomen, zullen overleven omdat ze het Neo R- gen hebben. Ook zullen cellen, waar de vector het beoogde gen heeft vervangen door homologe recombinatie, het TK-gen niet hebben, waardoor ze kunnen overleven in aanwezigheid van het medicijn ganciclovir. Daarom wordt blootstelling aan ganciclovir gebruikt om cellen te elimineren waarbij de vector willekeurig in hun genoom is ingebracht, omdat deze cellen thet TK-gen.

De cellen met het gen op de juiste manier uitgeschakeld, worden vervolgens ingebracht in een muizenembryo, dat wordt geïmplanteerd in de baarmoeder van een vrouwtje, waar het zich ontwikkelt tot de geboorte. De resulterende muis is een hersenschim - wat betekent dat hij is samengesteld uit een mengsel van cellen - sommige met normaal DNA uit het embryo, en sommige met het gen uitgeschakeld op één chromosoom van de gemanipuleerde cellen. Deze muizen worden gefokt en nakomelingen die het gen in hun kiembaan bevatten, worden verder gekruist om een reeks muizen te creëren waarin elke cel homozygoot is voor de knock-out. Deze knock-outmuizen kunnen vervolgens worden gebruikt om de genfunctie te bestuderen.


Aanbevolen Lectuur

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter