Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.8: In-vitro mutagenese
INHOUDSOPGAVE

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
In-vitro Mutagenesis
 
TRANSCRIPT

15.8: In-vitro mutagenese

Om meer te weten te komen over de functie van een gen, kunnen onderzoekers observeren wat er gebeurt als het gen wordt geïnactiveerd of "uitgeschakeld", door genetisch gemanipuleerde knock-outdieren te maken. Knock-out-muizen zijn bijzonder nuttig geweest als modellen voor ziekten bij de mens zoals kanker, de ziekte van Parkinson en diabetes.

Het proces

Genen kunnen willekeurig worden uitgeschakeld, of specifieke genen kunnen doelgericht worden uitgeschakeld. Om een bepaald gen uit te schakelen, wordt een gemanipuleerd stuk DNA, een targeting-vector genaamd, gebruikt om het normale gen te vervangen, waardoor het geïnactiveerd wordt.

Targeting-vectoren hebben sequenties die aan elk uiteinde identiek - of homoloog - zijn aan de sequenties die elke kant van het betreffende gen flankeren. Deze homologe sequenties stellen de doelgerichte vector in staat het gen te vervangen door homologe recombinatie - een proces dat van nature plaatsvindt tussen DNA met vergelijkbare sequenties tijdens meiose.

De targeting-vector wordt geïntroduceerd in de embryonale stamcel van muizen tijdens het kweken, met behulp van methoden zoals elektroporatie - gebruik van elektrische pulsen om tijdelijk poriën in het celmembraan te creëren. Om de cellen te identificeren waarin het vector het gen op de juiste manier heeft vervangen, bezit het een positieve selectiemarker tussen de homologe gebieden - zoals het gen voor neomycineresistentie (Neo R ); en een negatieve selectiemarker na een van de homologe regio's - zoals het gen voor virale thymidinekinase (TK) .

De cellen worden blootgesteld aan neomycine en alleen degenen die de vector in hun DNA hebben opgenomen, zullen overleven omdat ze het Neo R- gen hebben. Ook zullen cellen, waar de vector het beoogde gen heeft vervangen door homologe recombinatie, het TK-gen niet hebben, waardoor ze kunnen overleven in de aanwezigheid van het medicijn ganciclovir. Daarom wordt de blootstelling aan ganciclovir gebruikt om cellen te elimineren waarbij de vector willekeurig in hun genoom is ingebracht, omdat deze cellen het TK-gen bevatten.

De cellen waarin het gen op de juiste manier is uitgeschakeld, worden vervolgens ingebracht in een muizenembryo. Dit embryo wordt geïmplanteerd in de baarmoeder van een vrouwtje, waar het zich ontwikkelt tot de geboorte. De resulterende muis is een chimera - wat betekent dat hij is samengesteld uit een mengsel van cellen - sommige met normaal DNA uit het embryo, en sommige met het gen uitgeschakeld op één chromosoom van de gemanipuleerde cellen. Deze muizen worden gefokt en nakomelingen die het gen in hun kiembaan bevatten, worden verder gekruist om een reeks muizen te creëren waarin elke cel homozygoot is voor de knock-out. Deze knock-out muizen kunnen vervolgens worden gebruikt om de genfunctie te bestuderen.


Aanbevolen Lectuur

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter