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15.8: In-vitro-Mutagenese
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In-vitro Mutagenesis
 
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15.8: In-vitro Mutagenesis

15.8: In-vitro-Mutagenese

To learn more about the function of a gene, researchers can observe what happens when the gene is inactivated or “knocked out,” by creating genetically engineered knockout animals. Knockout mice have been particularly useful as models for human diseases such as cancer, Parkinson’s disease, and diabetes.

The Process

Genes can be randomly knocked out, or specific genes can be targeted. To knock out a particular gene, an engineered piece of DNA called a targeting vector is used to replace the normal gene, thereby inactivating it.

Targeting vectors have sequences on each end that are identical—or homologous— to the sequences flanking each side of the gene of interest. These homologous sequences allow the targeting vector to replace the gene through homologous recombination—a process that occurs naturally between DNA with similar sequences during meiosis.

The targeting vector is introduced into mouse embryonic stem cells in culture, using methods such as electroporation—use of electric pulses to temporarily create pores in the cell membrane. Typically, to identify cells where the vector has properly replaced the gene, it is designed to include a positive selection marker—such as the gene for neomycin resistance (NeoR)—between the homologous regions; and a negative selection marker—such as the gene for viral thymidine kinase (TK)—after one of the homologous regions.

The cells are exposed to neomycin, and only those that have incorporated the vector into their DNA will survive because they have the NeoR gene. Also, cells, where the vector has replaced the targeted gene through homologous recombination, will not have the TK gene, allowing them to survive in the presence of the drug ganciclovir. Therefore, exposure to ganciclovir is used to eliminate cells that have the vector randomly inserted into their genome, because these cells will have the TK gene.

The cells with the gene properly knocked out are then inserted into a mouse embryo, which is implanted into the uterus of a female, where it develops until birth. The resulting mouse is a chimera—meaning it is composed of a mixture of cells—some with normal DNA from the embryo, and some with the gene knocked out on one chromosome from the engineered cells. These mice are bred, and offspring containing the gene in their germline are further crossbred to create a line of mice where every cell is homozygous for the knockout. These knockout mice can then be used to study gene function.

Um mehr über die Funktion eines Gens zu erfahren, können Forscher beobachten, was passiert, wenn das Gen inaktiviert oder durch die Schaffung genetisch manipulierter "Knockout-Tiere“ ausgeschaltet wird. Knockout-Mäuse sind besonders nützlich als Modelle für menschliche Krankheiten wie Krebs, Parkinson und Diabetes.

Der Prozess

Die Gene können zufällig ausgeschaltet werden, oder es können bestimmte Gene gezielt angegriffen werden. Um ein bestimmtes Gen auszuschalten, wird ein künstliches Stück DNA, ein sogenannter Targeting-Vektor, verwendet. Dieser ersetzt das normale Gen inaktiviert es dadurch.

Targeting Vektoren haben an jedem Ende Sequenzen, die identisch bzw. homolog zu den Sequenzen sind, die jede Seite des interessierenden Gens flankieren. Diese homologen Sequenzen erlauben es dem Zielvektor, das Gen durch homologe Rekombination zu ersetzen. Das ist ein Prozess, der auf natürliche Weise zwischen DNA mit ähnlichen Sequenzen während der Meiose auftritt.

Der Targeting-Vektor wird in embryonale Stammzellen der Maus in Kultur eingebracht. Dabei werden Methoden wie die Elektroporation, Verwendung von elektrischen Impulsen zur temporären Erzeugung von Poren, in der Zellmembran verwendet. Um Zellen zu identifizieren, bei denen der Vektor das Gen richtig ersetzt hat, wird er typischerweise so gestaltet, dass er einen positiven Selektionsmarker wie z.B. das Gen für Neomycin-Resistenz (NeoR) zwischen den homologen Regionen und einen negativen Selektionsmarker enthält. Ein negativer Selektionsmarker ist beispielsweise das Gen für virale Thymidin-Kinase (TK).

Die Zellen werden dann Neomycin ausgesetzt. Nur diejenigen, die den Vektor in ihre DNA eingebaut haben, werden überleben, weil sie das Gen NeoR haben. Auch Zellen, bei denen der Vektor das Zielgen durch homologe Rekombination ersetzt hat, werden das TK-Gen nicht besitzen. So können sie in Gegenwart des Medikaments Ganciclovir überleben. Daher wird die Exposition gegenüber Ganciclovir dazu verwendet, Zellen zu eliminieren, die den Vektor zufällig in ihr Genom eingefügt haben, weil diese Zellen das TK-Gen haben werden.

Die Zellen mit dem richtig ausgeschalteten Gen werden dann in einen Maus-Embryo eingesetzt, der in die Gebärmutter einer Frau eingepflanzt wird, wo er sich bis zur Geburt entwickelt. Die resultierende Maus ist eine Chimäre. Das heißt, dass sie vermischte Zellen besitzt. Einige dieser Zellen weisen normale DNA aus dem Embryo auf, während andere das ausgeschaltete Gen auf einem Chromosom aus den manipulierten Zellen besitzen. Diese Mäuse werden gezüchtet. Nachkommen, die das Gen in ihrer Keimbahn enthalten, werden weiter gekreuzt, um eine Linie von Mäusen zu schaffen, bei der jede Zelle homozygot für den Knockout ist. Diese Knockout-Mäuse können dann zur Untersuchung der Genfunktion verwendet werden.


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