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15.8: In-vitro-Mutagenese
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PROTOKOLLE

15.8: In-vitro-Mutagenese

Um mehr über die Funktion eines Gens zu erfahren, können Forscher beobachten, was passiert, wenn das Gen inaktiviert oder durch die Schaffung genetisch manipulierter "Knockout-Tiere“ ausgeschaltet wird. Knockout-Mäuse sind besonders nützlich als Modelle für menschliche Krankheiten wie Krebs, Parkinson und Diabetes.

Der Prozess

Die Gene können zufällig ausgeschaltet werden, oder es können bestimmte Gene gezielt angegriffen werden. Um ein bestimmtes Gen auszuschalten, wird ein künstliches Stück DNA, ein sogenannter Targeting-Vektor, verwendet. Dieser ersetzt das normale Gen inaktiviert es dadurch.

Targeting Vektoren haben an jedem Ende Sequenzen, die identisch bzw. homolog zu den Sequenzen sind, die jede Seite des interessierenden Gens flankieren. Diese homologen Sequenzen erlauben es dem Zielvektor, das Gen durch homologe Rekombination zu ersetzen. Das ist ein Prozess, der auf natürliche Weise zwischen DNA mit ähnlichen Sequenzen während der Meiose auftritt.

Der Targeting-Vektor wird in embryonale Stammzellen der Maus in Kultur eingebracht. Dabei werden Methoden wie die Elektroporation, Verwendung von elektrischen Impulsen zur temporären Erzeugung von Poren, in der Zellmembran verwendet. Um Zellen zu identifizieren, bei denen der Vektor das Gen richtig ersetzt hat, wird er typischerweise so gestaltet, dass er einen positiven Selektionsmarker wie z.B. das Gen für Neomycin-Resistenz (NeoR) zwischen den homologen Regionen und einen negativen Selektionsmarker enthält. Ein negativer Selektionsmarker ist beispielsweise das Gen für virale Thymidin-Kinase (TK).

Die Zellen werden dann Neomycin ausgesetzt. Nur diejenigen, die den Vektor in ihre DNA eingebaut haben, werden überleben, weil sie das Gen NeoR haben. Auch Zellen, bei denen der Vektor das Zielgen durch homologe Rekombination ersetzt hat, werden das TK-Gen nicht besitzen. So können sie in Gegenwart des Medikaments Ganciclovir überleben. Daher wird die Exposition gegenüber Ganciclovir dazu verwendet, Zellen zu eliminieren, die den Vektor zufällig in ihr Genom eingefügt haben, weil diese Zellen das TK-Gen haben werden.

Die Zellen mit dem richtig ausgeschalteten Gen werden dann in einen Maus-Embryo eingesetzt, der in die Gebärmutter einer Frau eingepflanzt wird, wo er sich bis zur Geburt entwickelt. Die resultierende Maus ist eine Chimäre. Das heißt, dass sie vermischte Zellen besitzt. Einige dieser Zellen weisen normale DNA aus dem Embryo auf, während andere das ausgeschaltete Gen auf einem Chromosom aus den manipulierten Zellen besitzen. Diese Mäuse werden gezüchtet. Nachkommen, die das Gen in ihrer Keimbahn enthalten, werden weiter gekreuzt, um eine Linie von Mäusen zu schaffen, bei der jede Zelle homozygot für den Knockout ist. Diese Knockout-Mäuse können dann zur Untersuchung der Genfunktion verwendet werden.


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