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15.8: In-vitro-Mutagenese
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In-vitro Mutagenesis
 
PROTOKOLLE

15.8: In-vitro-Mutagenese

Um mehr über die Funktion eines Gens zu erfahren, können Forscher beobachten, was passiert, wenn das Gen inaktiviert oder entfernt (knock out) durch die Schaffung genetisch manipulierter "Knockout-Tiere“. Knockout-Mäuse erwiesen sich als besonders nützliches Modell für menschliche Krankheiten wie Krebs, Parkinson und Diabetes.

Der Prozess

Gene können zufällig ausgeschalten werden, oder es können bestimmte Gene gezielt manipuliert werden. Um ein bestimmtes Gen auszuschalten, wird ein künstliches Stück DNA, ein sogenannter Targeting-Vektor, verwendet. Dieser ersetzt das normale Gen und inaktiviert es dadurch.

Targeting-Vektoren haben an jedem Ende Sequenzen, die identisch bzw. homolog zu den Sequenzen sind, die die Seiten des gewünschten Gens flankieren. Diese homologen Sequenzen erlauben es dem Zielvektor, das Gen durch homologe Rekombination zu ersetzen. Das ist ein Prozess, der auf natürliche Weise zwischen DNA mit ähnlichen Sequenzen während der Meiose auftritt.

Der Targeting-Vektor wird in kultivierte embryonale Stammzellen der Maus eingeführt. Dabei werden Methoden wie die Elektroporation, das ist die Verwendung von elektrischen Impulsen zur temporären Erzeugung von Poren, in der Zellmembran verwendet. Um Zellen zu identifizieren, bei denen der Vektor das Gen richtig ersetzt hat, enthält er typischerweise einen positiven Selektionsmarker, wie z.B. das Gen für Neomycin-Resistenz (NeoR), zwischen den homologen Regionen. Zusätzlich enthält er nach einer der homologen Regionen, auch einen negativen Selektionsmarker, wie zum Beispiel das Gen für virale Thymidin-Kinase (TK).

Die Zellen werden dann Neomycin ausgesetzt und nur, die die den Vektor in ihre DNA eingebaut haben, werden überleben, da sie das NeoR-Gen haben. Nur die Zellen, bei denen der Vektor das Zielgen durch homologe Rekombination ersetzt hat, haben kein TK-Gen und können somit in Gegenwart des Medikaments Ganciclovir überleben. Daher wird Ganciclovir verwendet, Zellen zu eliminieren, die den Vektor zufällig in ihr Genom eingefügt haben, da diese Zellen das TK-Gen haben werden.

Die Zellen mit dem richtig inaktiviertem Gen werden dann in einen Maus-Embryo eingesetzt, der in die Gebärmutter eines Weibchens eingepflanzt wird, wo er sich bis zur Geburt entwickelt. Die resultierende Maus ist eine Chimäre. Das heißt, dass sie vermischte Zellen besitzt. Einige dieser Zellen haben die normale DNA von dem Embryo, während andere das ausgeschaltete Gen auf einem Chromosom aus den manipulierten Zellen besitzen. Diese Mäuse werden gezüchtet und die Nachkommen, die das Gen in ihrer Keimbahn enthalten, werden weiter gekreuzt, um eine Linie von Mäusen zu schaffen, bei der jede Zelle homozygot für den Knockout ist. Diese Knockout-Mäuse können dann zur Untersuchung der Genfunktion verwendet werden.


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Tags

In-vitro Mutagenesis Knock Out Gene Targeting Vector Neomycin Resistance Thymidine Kinase Embryonic Stem Cells Homologous Recombination Positive Selection Marker Negative Selection Marker Knockout Mice Genetically Engineered Animals Human Diseases

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