Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.8: In-vitro Mutajenez
TABLE OF
CONTENTS

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
In-vitro Mutagenesis
 
TRANSCRIPT

15.8: In-vitro Mutagenesis

15.8: In-vitro Mutajenez

To learn more about the function of a gene, researchers can observe what happens when the gene is inactivated or “knocked out,” by creating genetically engineered knockout animals. Knockout mice have been particularly useful as models for human diseases such as cancer, Parkinson’s disease, and diabetes.

The Process

Genes can be randomly knocked out, or specific genes can be targeted. To knock out a particular gene, an engineered piece of DNA called a targeting vector is used to replace the normal gene, thereby inactivating it.

Targeting vectors have sequences on each end that are identical—or homologous— to the sequences flanking each side of the gene of interest. These homologous sequences allow the targeting vector to replace the gene through homologous recombination—a process that occurs naturally between DNA with similar sequences during meiosis.

The targeting vector is introduced into mouse embryonic stem cells in culture, using methods such as electroporation—use of electric pulses to temporarily create pores in the cell membrane. Typically, to identify cells where the vector has properly replaced the gene, it is designed to include a positive selection marker—such as the gene for neomycin resistance (NeoR)—between the homologous regions; and a negative selection marker—such as the gene for viral thymidine kinase (TK)—after one of the homologous regions.

The cells are exposed to neomycin, and only those that have incorporated the vector into their DNA will survive because they have the NeoR gene. Also, cells, where the vector has replaced the targeted gene through homologous recombination, will not have the TK gene, allowing them to survive in the presence of the drug ganciclovir. Therefore, exposure to ganciclovir is used to eliminate cells that have the vector randomly inserted into their genome, because these cells will have the TK gene.

The cells with the gene properly knocked out are then inserted into a mouse embryo, which is implanted into the uterus of a female, where it develops until birth. The resulting mouse is a chimera—meaning it is composed of a mixture of cells—some with normal DNA from the embryo, and some with the gene knocked out on one chromosome from the engineered cells. These mice are bred, and offspring containing the gene in their germline are further crossbred to create a line of mice where every cell is homozygous for the knockout. These knockout mice can then be used to study gene function.

Bir genin işlevi hakkında daha fazla bilgi edinmek için, araştırmacılar genetiği değiştirilmiş nakavt hayvanlar oluşturarak gen inaktive veya "nakavt" olduğunda ne olduğunu gözlemleyebilirsiniz. Nakavt fareler kanser, Parkinson hastalığı ve diyabet gibi insan hastalıkları için modeller olarak özellikle yararlı olmuştur.

Süreç

Genler rastgele nakavt edilebilir veya belirli genler hedeflenebilir. Belirli bir geni yok etmek için, hedefvektör adı verilen tasarlanmış bir DNA parçası normal geni değiştirmek için kullanılır ve bu da geni etkisiz hale getirmekiçin kullanılır.

Hedefleme vektörlerinin her iki ucunda, ilgi geninin her iki tarafını çevreleyen dizilerle özdeş veya homolog diziler vardır. Bu homolog diziler, hedefleme vektörüne, meyozis sırasında benzer dizilerle DNA arasında doğal olarak oluşan homolog rekombinasyon yoluyla genin yerini almasına olanak sağlar.

Hedefleme vektörü, hücre zarında geçici olarak gözenekleri oluşturmak için elektrik darbelerinin kullanılması gibi yöntemler kullanılarak kültürde fare embriyonik kök hücrelerine tanıtılır. Tipik olarak, vektörün geni düzgün bir şekilde değiştirdiği hücreleri tanımlamak için, homolog bölgeler arasında neomisin direnci (NeoR)— geni gibi pozitif bir seçim belirteci içerecek şekilde tasarlanmıştır; ve homolog bölgelerden sonra viral timidin kizaz (TK) geni gibi negatif bir seçim belirteci.

Hücreler neomisine maruz kalırlar ve sadece vektörü DNA'larına dahil edenler hayatta kalırlar çünkü NeoR genine sahiptirler. Ayrıca, vektörhomolog rekombinasyon yoluyla hedeflenen gen yerini almıştır hücreler, onları ilaç ganciclovir varlığında hayatta sağlayan, TK geni olmayacaktır. Bu nedenle, gansiclovir maruz kalma rastgele kendi genomiçine yerleştirilen vektör olan hücreleri ortadan kaldırmak için kullanılır, Bu hücreler TK geni olacak çünkü.

Geni düzgün bir şekilde nakavt eden hücreler daha sonra bir fare embriyosuna yerleştirilir, bu embriyo bir dişinin rahmine yerleştirilir ve doğuma kadar gelişir. Ortaya çıkan fare bir kimeradır– yani bazıları embriyodan normal DNA ile, bazıları ise mühendislik hücrelerinden bir kromozoma elonlu gen içeren bir hücre karışımından oluşur. Bu fareler yetiştirilir ve mikroplarındaki geni içeren yavrular, her hücrenin nakavt için homozigot olduğu bir fare hattı oluşturmak için daha da çaprazlanırlar. Bu nakavt fareler daha sonra gen fonksiyonu çalışma için kullanılabilir.


Suggested Reading

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter