Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.8: In-vitro Mutajenez

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
In-vitro Mutajenez
 

15.8: In-vitro Mutajenez

Bir genin işlevi hakkında daha fazla bilgi edinmek için, araştırmacılar genetiği değiştirilmiş nakavt hayvanlar oluşturarak gen inaktive veya "nakavt" olduğunda ne olduğunu gözlemleyebilirsiniz. Nakavt fareler kanser, Parkinson hastalığı ve diyabet gibi insan hastalıkları için modeller olarak özellikle yararlı olmuştur.

Süreç

Genler rastgele nakavt edilebilir veya belirli genler hedeflenebilir. Belirli bir geni yok etmek için, hedefvektör adı verilen tasarlanmış bir DNA parçası normal geni değiştirmek için kullanılır ve bu da geni etkisiz hale getirmekiçin kullanılır.

Hedefleme vektörlerinin her iki ucunda, ilgi geninin her iki tarafını çevreleyen dizilerle özdeş veya homolog diziler vardır. Bu homolog diziler, hedefleme vektörüne, meyozis sırasında benzer dizilerle DNA arasında doğal olarak oluşan homolog rekombinasyon yoluyla genin yerini almasına olanak sağlar.

Hedefleme vektörü, hücre zarında geçici olarak gözenekleri oluşturmak için elektrik darbelerinin kullanılması gibi yöntemler kullanılarak kültürde fare embriyonik kök hücrelerine tanıtılır. Tipik olarak, vektörün geni düzgün bir şekilde değiştirdiği hücreleri tanımlamak için, homolog bölgeler arasında neomisin direnci (NeoR)— geni gibi pozitif bir seçim belirteci içerecek şekilde tasarlanmıştır; ve homolog bölgelerden sonra viral timidin kizaz (TK) geni gibi negatif bir seçim belirteci.

Hücreler neomisine maruz kalırlar ve sadece vektörü DNA'larına dahil edenler hayatta kalırlar çünkü NeoR genine sahiptirler. Ayrıca, vektörhomolog rekombinasyon yoluyla hedeflenen gen yerini almıştır hücreler, onları ilaç ganciclovir varlığında hayatta sağlayan, TK geni olmayacaktır. Bu nedenle, gansiclovir maruz kalma rastgele kendi genomiçine yerleştirilen vektör olan hücreleri ortadan kaldırmak için kullanılır, Bu hücreler TK geni olacak çünkü.

Geni düzgün bir şekilde nakavt eden hücreler daha sonra bir fare embriyosuna yerleştirilir, bu embriyo bir dişinin rahmine yerleştirilir ve doğuma kadar gelişir. Ortaya çıkan fare bir kimeradır– yani bazıları embriyodan normal DNA ile, bazıları ise mühendislik hücrelerinden bir kromozoma elonlu gen içeren bir hücre karışımından oluşur. Bu fareler yetiştirilir ve mikroplarındaki geni içeren yavrular, her hücrenin nakavt için homozigot olduğu bir fare hattı oluşturmak için daha da çaprazlanırlar. Bu nakavt fareler daha sonra gen fonksiyonu çalışma için kullanılabilir.


Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter