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15.8: Mutagenèse in vitro
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In-vitro Mutagenesis
 
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15.8: In-vitro Mutagenesis

15.8: Mutagenèse in vitro

To learn more about the function of a gene, researchers can observe what happens when the gene is inactivated or “knocked out,” by creating genetically engineered knockout animals. Knockout mice have been particularly useful as models for human diseases such as cancer, Parkinson’s disease, and diabetes.

The Process

Genes can be randomly knocked out, or specific genes can be targeted. To knock out a particular gene, an engineered piece of DNA called a targeting vector is used to replace the normal gene, thereby inactivating it.

Targeting vectors have sequences on each end that are identical—or homologous— to the sequences flanking each side of the gene of interest. These homologous sequences allow the targeting vector to replace the gene through homologous recombination—a process that occurs naturally between DNA with similar sequences during meiosis.

The targeting vector is introduced into mouse embryonic stem cells in culture, using methods such as electroporation—use of electric pulses to temporarily create pores in the cell membrane. Typically, to identify cells where the vector has properly replaced the gene, it is designed to include a positive selection marker—such as the gene for neomycin resistance (NeoR)—between the homologous regions; and a negative selection marker—such as the gene for viral thymidine kinase (TK)—after one of the homologous regions.

The cells are exposed to neomycin, and only those that have incorporated the vector into their DNA will survive because they have the NeoR gene. Also, cells, where the vector has replaced the targeted gene through homologous recombination, will not have the TK gene, allowing them to survive in the presence of the drug ganciclovir. Therefore, exposure to ganciclovir is used to eliminate cells that have the vector randomly inserted into their genome, because these cells will have the TK gene.

The cells with the gene properly knocked out are then inserted into a mouse embryo, which is implanted into the uterus of a female, where it develops until birth. The resulting mouse is a chimera—meaning it is composed of a mixture of cells—some with normal DNA from the embryo, and some with the gene knocked out on one chromosome from the engineered cells. These mice are bred, and offspring containing the gene in their germline are further crossbred to create a line of mice where every cell is homozygous for the knockout. These knockout mice can then be used to study gene function.

Pour en savoir plus sur la fonction d’un gène, les chercheurs peuvent observer ce qui se passe lorsque le gène est inactivé ou « assommé », en créant des animaux génétiquement modifiés knockout. Les souris knockout ont été particulièrement utiles comme modèles pour les maladies humaines telles que le cancer, la maladie de Parkinson, et le diabète.

Le processus

Les gènes peuvent être éliminés au hasard, ou des gènes spécifiques peuvent être ciblés. Pour assommer un gène particulier, un morceau d’ADN conçu appelé vecteur de ciblage est utilisé pour remplacer le gène normal, l’inactivant ainsi.

Les vecteurs de ciblage ont des séquences à chaque extrémité qui sont identiques ou homologues aux séquences flanquant chaque côté du gène d’intérêt. Ces séquences homologues permettent au vecteur de ciblage de remplacer le gène par une recombinaison homologue, un processus qui se produit naturellement entre l’ADN et des séquences similaires pendant la méiose.

Le vecteur de ciblage est introduit dans les cellules souches embryonnaires de souris en culture, en utilisant des méthodes telles que l’électroporation — l’utilisation d’impulsions électriques pour créer temporairement des pores dans la membrane cellulaire. Typiquement, pour identifier les cellules où le vecteur a correctement remplacé le gène, il est conçu pour inclure un marqueur de sélection positif - tel que le gène pour la résistance à la néomycine (NeoR)- entre les régions homologues; et un marqueur de sélection négatif, comme le gène de la thymidine kinase virale (TK) — après l’une des régions homologues.

Les cellules sont exposées à la néomycine, et seuls ceux qui ont incorporé le vecteur dans leur ADN survivront parce qu’ils ont le gène NeoR. En outre, les cellules, où le vecteur a remplacé le gène ciblé par la recombinaison homologue, n’auront pas le gène des savoirs T, ce qui leur permettra de survivre en présence du ganciclovir médicamenteux. Par conséquent, l’exposition au ganciclovir est utilisée pour éliminer les cellules qui ont le vecteur inséré au hasard dans leur génome, parce que ces cellules auront le gène des savoirs T.

Les cellules avec le gène correctement assommé sont ensuite insérées dans un embryon de souris, qui est implanté dans l’utérus d’une femelle, où il se développe jusqu’à la naissance. La souris qui en résulte est une chimère, c’est-à-dire qu’elle est composée d’un mélange de cellules, certaines avec l’ADN normal de l’embryon, et d’autres avec le gène assommé sur un chromosome des cellules modifiées. Ces souris sont élevées, et la progéniture contenant le gène dans leur lignée germinale sont encore croisées pour créer une ligne de souris où chaque cellule est homozygote pour le knock-out. Ces souris knock-out peuvent ensuite être utilisées pour étudier la fonction des gènes.


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