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15.8: Mutagénèse in vitro
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15.8: Mutagénèse in vitro

Pour en savoir plus sur la fonction d’un gène, les chercheurs peuvent observer ce qui se passe lorsque le gène est inactivé ou invalidé, en créant des animaux “ knock-out ” génétiquement modifiés. Les souris knock-out ont été particulièrement utiles comme modèles pour les maladies humaines telles que le cancer, la maladie de Parkinson et le diabète.

Le procédé

Les gènes peuvent être invalidés au hasard, ou des gènes spécifiques peuvent être ciblés. Pour invalider un gène particulier, un morceau d’ADN conçu s'appelant un vecteur de ciblage est utilisé pour remplacer le gène normal, l’inactivant ainsi.

Les vecteurs de ciblage ont des séquences à chaque extrémité qui sont identiques, ou homologues, aux séquences encadrant de chaque côté le gène d’intérêt. Ces séquences homologues permettent au vecteur de ciblage de remplacer le gène par le biais d’une recombinaison homologue — un mécanisme qui se produit naturellement entre l’ADN et des séquences similaires pendant la méiose.

Le vecteur de ciblage est introduit dans les cellules souches embryonnaires de souris en culture, en utilisant des méthodes telles que l’électroporation — l’utilisation d’impulsions électriques pour créer temporairement des pores dans la membrane cellulaire. Normalement, afin d’identifier les cellules où le vecteur a correctement remplacé le gène, il est conçu pour inclure un marqueur de sélection positif — tel que le gène pour la résistance à la néomycine (NeoR) — entre les régions homologues ; et un marqueur de sélection négatif — comme le gène de la thymidine kinase virale (TK) — après l’une des régions homologues.

Les cellules sont exposées à la néomycine, et seules celles qui ont incorporé le vecteur dans leur ADN survivront parce qu’elles ont le gène NeoR. En outre, les cellules, où le vecteur a remplacé le gène ciblé par recombinaison homologue, n’auront pas le gène TK, ce qui leur permettra de survivre en présence du médicament ganciclovir. Par conséquent, l’exposition au ganciclovir est utilisée pour éliminer les cellules qui ont le vecteur inséré au hasard dans leur génome, parce que ces cellules auront le gène TK.

Les cellules avec le gène correctement invalidé sont ensuite insérées dans un embryon de souris, qui est implanté dans l’utérus d’une femelle, où il se développe jusqu’à la naissance. La souris qui en résulte est une chimère — c’est-à-dire qu’elle est composée d’un mélange de cellules, certaines avec l’ADN normal provenant de l’embryon, et d’autres avec le gène invalidé sur un chromosome des cellules modifiées. Ces souris sont élevées, et la progéniture contenant le gène dans leur lignée germinale est encore croisée pour créer une lignée de souris où chaque cellule est homozygote pour le knock-out. Ces souris knock-out peuvent ensuite être utilisées pour étudier la fonction des gènes.


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In-vitro Mutagenesis Knock Out Gene Targeting Vector Neomycin Resistance Thymidine Kinase Embryonic Stem Cells Homologous Recombination Positive Selection Marker Negative Selection Marker Knockout Mice Genetically Engineered Animals Human Diseases

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