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15.8: Mutagenèse in vitro
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Mutagenèse in vitro
 
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* La traduction du texte est générée par ordinateur

15.8: Mutagenèse in vitro

Pour en savoir plus sur la fonction d’un gène, les chercheurs peuvent observer ce qui se passe lorsque le gène est inactivé ou « assommé », en créant des animaux génétiquement modifiés knockout. Les souris knockout ont été particulièrement utiles comme modèles pour les maladies humaines telles que le cancer, la maladie de Parkinson, et le diabète.

Le processus

Les gènes peuvent être éliminés au hasard, ou des gènes spécifiques peuvent être ciblés. Pour assommer un gène particulier, un morceau d’ADN conçu appelé vecteur de ciblage est utilisé pour remplacer le gène normal, l’inactivant ainsi.

Les vecteurs de ciblage ont des séquences à chaque extrémité qui sont identiques ou homologues aux séquences flanquant chaque côté du gène d’intérêt. Ces séquences homologues permettent au vecteur de ciblage de remplacer le gène par une recombinaison homologue, un processus qui se produit naturellement entre l’ADN et des séquences similaires pendant la méiose.

Le vecteur de ciblage est introduit dans les cellules souches embryonnaires de souris en culture, en utilisant des méthodes telles que l’électroporation — l’utilisation d’impulsions électriques pour créer temporairement des pores dans la membrane cellulaire. Typiquement, pour identifier les cellules où le vecteur a correctement remplacé le gène, il est conçu pour inclure un marqueur de sélection positif - tel que le gène pour la résistance à la néomycine (NeoR)- entre les régions homologues; et un marqueur de sélection négatif, comme le gène de la thymidine kinase virale (TK) — après l’une des régions homologues.

Les cellules sont exposées à la néomycine, et seuls ceux qui ont incorporé le vecteur dans leur ADN survivront parce qu’ils ont le gène NeoR. En outre, les cellules, où le vecteur a remplacé le gène ciblé par la recombinaison homologue, n’auront pas le gène des savoirs T, ce qui leur permettra de survivre en présence du ganciclovir médicamenteux. Par conséquent, l’exposition au ganciclovir est utilisée pour éliminer les cellules qui ont le vecteur inséré au hasard dans leur génome, parce que ces cellules auront le gène des savoirs T.

Les cellules avec le gène correctement assommé sont ensuite insérées dans un embryon de souris, qui est implanté dans l’utérus d’une femelle, où il se développe jusqu’à la naissance. La souris qui en résulte est une chimère, c’est-à-dire qu’elle est composée d’un mélange de cellules, certaines avec l’ADN normal de l’embryon, et d’autres avec le gène assommé sur un chromosome des cellules modifiées. Ces souris sont élevées, et la progéniture contenant le gène dans leur lignée germinale sont encore croisées pour créer une ligne de souris où chaque cellule est homozygote pour le knock-out. Ces souris knock-out peuvent ensuite être utilisées pour étudier la fonction des gènes.


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