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15.8: Mutagênese In-Vitro
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In-vitro Mutagenesis
 
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15.8: In-vitro Mutagenesis

15.8: Mutagênese In-Vitro

To learn more about the function of a gene, researchers can observe what happens when the gene is inactivated or “knocked out,” by creating genetically engineered knockout animals. Knockout mice have been particularly useful as models for human diseases such as cancer, Parkinson’s disease, and diabetes.

The Process

Genes can be randomly knocked out, or specific genes can be targeted. To knock out a particular gene, an engineered piece of DNA called a targeting vector is used to replace the normal gene, thereby inactivating it.

Targeting vectors have sequences on each end that are identical—or homologous— to the sequences flanking each side of the gene of interest. These homologous sequences allow the targeting vector to replace the gene through homologous recombination—a process that occurs naturally between DNA with similar sequences during meiosis.

The targeting vector is introduced into mouse embryonic stem cells in culture, using methods such as electroporation—use of electric pulses to temporarily create pores in the cell membrane. Typically, to identify cells where the vector has properly replaced the gene, it is designed to include a positive selection marker—such as the gene for neomycin resistance (NeoR)—between the homologous regions; and a negative selection marker—such as the gene for viral thymidine kinase (TK)—after one of the homologous regions.

The cells are exposed to neomycin, and only those that have incorporated the vector into their DNA will survive because they have the NeoR gene. Also, cells, where the vector has replaced the targeted gene through homologous recombination, will not have the TK gene, allowing them to survive in the presence of the drug ganciclovir. Therefore, exposure to ganciclovir is used to eliminate cells that have the vector randomly inserted into their genome, because these cells will have the TK gene.

The cells with the gene properly knocked out are then inserted into a mouse embryo, which is implanted into the uterus of a female, where it develops until birth. The resulting mouse is a chimera—meaning it is composed of a mixture of cells—some with normal DNA from the embryo, and some with the gene knocked out on one chromosome from the engineered cells. These mice are bred, and offspring containing the gene in their germline are further crossbred to create a line of mice where every cell is homozygous for the knockout. These knockout mice can then be used to study gene function.

Para saber mais sobre a função de um gene, os pesquisadores podem observar o que acontece quando o gene é inativado ou "nocauteado", criando animais de nocaute geneticamente modificados. Camundongos nocautes têm sido particularmente úteis como modelos para doenças humanas como câncer, doença de Parkinson e diabetes.

O Processo

Genes podem ser aleatoriamente eliminados, ou genes específicos podem ser alvos. Para derrubar um gene em particular, um pedaço de DNA projetado chamado vetor de alvo é usado para substituir o gene normal, inativando-o assim.

Vetores de segmentação têm sequências em cada extremidade idênticas — ou homologous — às sequências que flanqueiam cada lado do gene de interesse. Essas sequências homólogas permitem que o vetor de alvo substitua o gene através da recombinação homologous — um processo que ocorre naturalmente entre o DNA com sequências semelhantes durante a meiose.

O vetor de alvo é introduzido em células-tronco embrionárias do rato na cultura, usando métodos como eletroporação — uso de pulsos elétricos para criar temporariamente poros na membrana celular. Normalmente, para identificar células onde o vetor substituiu corretamente o gene, ele foi projetado para incluir um marcador de seleção positivo — como o gene para resistência à neomicina (NeoR)— entre as regiões homologous; e um marcador de seleção negativo — como o gene da quinase viral de timmidina (TK) — após uma das regiões homólogos.

As células são expostas à neomicina, e somente aquelas que incorporaram o vetor em seu DNA sobreviverão porque têm o gene NeoR. Além disso, as células, onde o vetor substituiu o gene alvo através da recombinação homólogo, não terão o gene TK, permitindo-lhes sobreviver na presença da droga ganciclovir. Portanto, a exposição ao ganciclovir é usada para eliminar células que têm o vetor aleatoriamente inserido em seu genoma, porque essas células terão o gene TK.

As células com o gene devidamente eliminado são então inseridas em um embrião de camundongos, que é implantado no útero de uma fêmea, onde se desenvolve até o nascimento. O rato resultante é uma quimera — o que significa que é composta de uma mistura de células — algumas com DNA normal do embrião, e algumas com o gene eliminado em um cromossomo das células projetadas. Estes camundongos são criados, e os descendentes que contêm o gene em sua linha germinal são ainda mais cruzados para criar uma linha de ratos onde cada célula é homozigosa para o nocaute. Esses camundongos knockout podem então ser usados para estudar a função genética.


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