Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.8: Mutagénesis in vitro
TABLA DE
CONTENIDO

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
In-vitro Mutagenesis
 
TRANSCRIPCIÓN

15.8: In-vitro Mutagenesis

15.8: Mutagénesis in vitro

To learn more about the function of a gene, researchers can observe what happens when the gene is inactivated or “knocked out,” by creating genetically engineered knockout animals. Knockout mice have been particularly useful as models for human diseases such as cancer, Parkinson’s disease, and diabetes.

The Process

Genes can be randomly knocked out, or specific genes can be targeted. To knock out a particular gene, an engineered piece of DNA called a targeting vector is used to replace the normal gene, thereby inactivating it.

Targeting vectors have sequences on each end that are identical—or homologous— to the sequences flanking each side of the gene of interest. These homologous sequences allow the targeting vector to replace the gene through homologous recombination—a process that occurs naturally between DNA with similar sequences during meiosis.

The targeting vector is introduced into mouse embryonic stem cells in culture, using methods such as electroporation—use of electric pulses to temporarily create pores in the cell membrane. Typically, to identify cells where the vector has properly replaced the gene, it is designed to include a positive selection marker—such as the gene for neomycin resistance (NeoR)—between the homologous regions; and a negative selection marker—such as the gene for viral thymidine kinase (TK)—after one of the homologous regions.

The cells are exposed to neomycin, and only those that have incorporated the vector into their DNA will survive because they have the NeoR gene. Also, cells, where the vector has replaced the targeted gene through homologous recombination, will not have the TK gene, allowing them to survive in the presence of the drug ganciclovir. Therefore, exposure to ganciclovir is used to eliminate cells that have the vector randomly inserted into their genome, because these cells will have the TK gene.

The cells with the gene properly knocked out are then inserted into a mouse embryo, which is implanted into the uterus of a female, where it develops until birth. The resulting mouse is a chimera—meaning it is composed of a mixture of cells—some with normal DNA from the embryo, and some with the gene knocked out on one chromosome from the engineered cells. These mice are bred, and offspring containing the gene in their germline are further crossbred to create a line of mice where every cell is homozygous for the knockout. These knockout mice can then be used to study gene function.

Para obtener más información sobre la función de un gen, los investigadores pueden observar lo que sucede cuando el gen está inactivado o "derribado", mediante la creación de animales knockout genéticamente diseñados. Los ratones knockout han sido particularmente útiles como modelos para enfermedades humanas como el cáncer, la enfermedad de Parkinson y la diabetes.

El proceso

Los genes pueden ser eliminados al azar, o genes específicos pueden ser atacados. Para eliminar un gen en particular, se utiliza un fragmento de ADN diseñado llamado vector de orientación para reemplazar el gen normal, lo que lo inactiva.

Los vectores de destino tienen secuencias en cada extremo que son idénticas ,o homólodas— a las secuencias que flanquean cada lado del gen de interés. Estas secuencias homólolas permiten que el vector de orientación reemplace el gen a través de la recombinación homóloga, un proceso que ocurre naturalmente entre el ADN con secuencias similares durante la meiosis.

El vector de orientación se introduce en las células madre embrionarias de ratón en el cultivo, utilizando métodos como la electroporación: el uso de pulsos eléctricos para crear temporalmente poros en la membrana celular. Típicamente, para identificar las células donde el vector ha reemplazado correctamente el gen, está diseñado para incluir un marcador de selección positivo, como el gen de la resistencia a la neomicina (NeoR),entre las regiones homólofalas; y un marcador de selección negativo, como el gen de la timidina quinasa viral (CC.TT.) después de una de las regiones homólogias.

Las células están expuestas a la neomicina, y sólo las que han incorporado el vector en su ADN sobrevivirán porque tienen el gen NeoR. Además, las células, donde el vector ha reemplazado al gen objetivo a través de la recombinación homóloga, no tendrán el gen TK, lo que les permitirá sobrevivir en presencia del fármaco ganciclovir. Por lo tanto, la exposición a ganciclovir se utiliza para eliminar las células que tienen el vector insertado aleatoriamente en su genoma, porque estas células tendrán el gen TK.

Las células con el gen correctamente noqueado se insertan en un embrión de ratón, que se implanta en el útero de una hembra, donde se desarrolla hasta el nacimiento. El ratón resultante es una quimera, lo que significa que está compuesta por una mezcla de células, algunas con ADN normal del embrión, y otras con el gen noqueado en un cromosoma de las células de ingeniería. Estos ratones son criados, y la descendencia que contiene el gen en su línea germinal se cruzan aún más para crear una línea de ratones donde cada célula es homocigota para el knockout. Estos ratones knockout se pueden utilizar para estudiar la función génica.


Lectura sugerida

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter