Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.9: Aislamiento de ADN
TABLA DE
CONTENIDO

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
DNA Isolation
 
TRANSCRIPCIÓN

15.9: DNA Isolation

15.9: Aislamiento de ADN

DNA from cells is required for many biotechnology and research applications, such as molecular cloning. To remove and purify DNA from cells, researchers use various methods of DNA extraction. While the specifics of different protocols may vary, some general concepts underlie the process of DNA extraction.

The Process

First, cells need to be lysed—broken open—to release the DNA into solution. Cells can be physically lysed using equipment such as a homogenizer, sonicator, or bead beater, which grind or otherwise apply force to break the cells open. Often, substances such as detergent are added during lysis to chemically disrupt the lipid-based cell membranes—helping release the DNA from the nucleus and cell. The spinning in a centrifuge sediments the cell debris to the bottom, and the lysate—containing cellular materials—is collected for further processing.

The DNA must then be separated from other cellular molecules, such as RNA and proteins. Therefore, enzymes such as RNase and Proteinase K are often added during or after lysis to degrade RNA and proteins, respectively. Additionally, organic solvents such as phenol and chloroform are commonly used to separate DNA from protein. Typically, the sample is vortexed with phenol-chloroform and then centrifuged to separate the aqueous and organic phases in the tube. The DNA-containing aqueous phase at the top can then be pipetted off, leaving behind the protein in the organic phase.

Salts are often added during DNA extraction to stabilize the DNA and assist in precipitating it out of solution. A standard method of DNA precipitation is to add ice-cold alcohol, such as ethanol or isopropanol, to the sample. This causes the DNA to form a white, cloudy precipitate within the liquid in the tube.

The sample is then spun in a centrifuge, causing the DNA precipitate to collect at the bottom of the tube as a pellet. The pellet is washed by removing the liquid, washing in alcohol, and spinning it again. After the final wash, the pellet is re-suspended in a buffer—creating an aqueous solution of purified DNA that is ready to be studied or used in biotechnology.

El ADN de las células es necesario para muchas aplicaciones de biotecnología e investigación, como la clonación molecular. Para eliminar y purificar el ADN de las células, los investigadores utilizan varios métodos de extracción de ADN. Si bien los detalles de los diferentes protocolos pueden variar, algunos conceptos generales subyacen al proceso de extracción de ADN.

El proceso

En primer lugar, las células necesitan ser alicezadas (abiertas— para liberar el ADN en la solución. Las células se pueden alezar físicamente utilizando equipos como un homogeneizador, sonicador o batidor de cuentas, que moler o aplicar fuerza para romper las células abiertas. A menudo, sustancias como el detergente se añaden durante la lysis para interrumpir químicamente las membranas celulares basadas en lípidos, ayudando a liberar el ADN del núcleo y la célula. El hilado en una centrífuga sedimenta los desechos celulares hasta el fondo, y el izado, que contiene materiales celulares, se recoge para su posterior procesamiento.

El ADN debe separarse de otras moléculas celulares, como el ARN y las proteínas. Por lo tanto, enzimas como la RNase y la Proteinasa K a menudo se añaden durante o después de la lelisis para degradar el ARN y las proteínas, respectivamente. Además, los disolventes orgánicos como el fenol y el cloroformo se utilizan comúnmente para separar el ADN de las proteínas. Típicamente, la muestra se vórtice con fenol-cloroformo y luego se centrifuga para separar las fases acuosas y orgánicas en el tubo. La fase acuosa que contiene ADN en la parte superior se puede pipetear, dejando atrás la proteína en la fase orgánica.

Las sales a menudo se añaden durante la extracción de ADN para estabilizar el ADN y ayudar a precipitarlo fuera de la solución. Un método estándar de precipitación de ADN es agregar alcohol helado, como etanol o isopropanol, a la muestra. Esto hace que el ADN forme un precipitado blanco y turbio dentro del líquido en el tubo.

La muestra se hila en una centrífuga, haciendo que el precipitado de ADN se recoja en la parte inferior del tubo como un pellet. El pellet se lava retirando el líquido, lavándolo en alcohol y girando de nuevo. Después del lavado final, el pellet se vuelve a suspender en un tampón, creando una solución acuosa de ADN purificado que está lista para ser estudiada o utilizada en biotecnología.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter