Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.9: DNA-isolatie
INHOUDSOPGAVE

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
DNA Isolation
 
TRANSCRIPT

15.9: DNA Isolation

15.9: DNA-isolatie

DNA from cells is required for many biotechnology and research applications, such as molecular cloning. To remove and purify DNA from cells, researchers use various methods of DNA extraction. While the specifics of different protocols may vary, some general concepts underlie the process of DNA extraction.

The Process

First, cells need to be lysed—broken open—to release the DNA into solution. Cells can be physically lysed using equipment such as a homogenizer, sonicator, or bead beater, which grind or otherwise apply force to break the cells open. Often, substances such as detergent are added during lysis to chemically disrupt the lipid-based cell membranes—helping release the DNA from the nucleus and cell. The spinning in a centrifuge sediments the cell debris to the bottom, and the lysate—containing cellular materials—is collected for further processing.

The DNA must then be separated from other cellular molecules, such as RNA and proteins. Therefore, enzymes such as RNase and Proteinase K are often added during or after lysis to degrade RNA and proteins, respectively. Additionally, organic solvents such as phenol and chloroform are commonly used to separate DNA from protein. Typically, the sample is vortexed with phenol-chloroform and then centrifuged to separate the aqueous and organic phases in the tube. The DNA-containing aqueous phase at the top can then be pipetted off, leaving behind the protein in the organic phase.

Salts are often added during DNA extraction to stabilize the DNA and assist in precipitating it out of solution. A standard method of DNA precipitation is to add ice-cold alcohol, such as ethanol or isopropanol, to the sample. This causes the DNA to form a white, cloudy precipitate within the liquid in the tube.

The sample is then spun in a centrifuge, causing the DNA precipitate to collect at the bottom of the tube as a pellet. The pellet is washed by removing the liquid, washing in alcohol, and spinning it again. After the final wash, the pellet is re-suspended in a buffer—creating an aqueous solution of purified DNA that is ready to be studied or used in biotechnology.

DNA uit cellen is nodig voor veel biotechnologie- en onderzoekstoepassingen, zoals moleculair klonen. Om DNA uit cellen te verwijderen en te zuiveren, gebruiken onderzoekers verschillende methoden voor DNA-extractie. Hoewel de specifieke kenmerken van verschillende protocollen kunnen variëren, liggen enkele algemene concepten ten grondslag aan het proces van DNA-extractie.

Het proces

Ten eerste moeten cellen worden gelyseerd - opengebroken - om het DNA in oplossing te laten komen. Cellen kunnen fysiek worden gelyseerd met behulp van apparatuur zoals een homogenisator, ultrasoonapparaat of parelklopper, die malen of anderszins kracht uitoefenen om de cellen open te breken. Vaak worden tijdens de lysis stoffen zoals detergentia toegevoegd om de celmembranen op lipidenbasis chemisch te verstoren, waardoor het DNA uit de kern en cel vrijkomt. Door het ronddraaien in een centrifuge wordt het celafval naar de bodem afgezet, en het lysaat - dat cellulaire materialen bevat - wordt verzameld voor verdere verwerking.

Het DNA moet dan worden gescheiden van andere cellulaire moleculen, zoals RNAen eiwitten. Daarom worden enzymen zoals RNase en Proteinase K vaak toegevoegd tijdens of na lysis om respectievelijk RNA en eiwitten af te breken. Bovendien worden organische oplosmiddelen zoals fenol en chloroform vaak gebruikt om DNA van eiwit te scheiden. Typisch wordt het monster gewerveld met fenol-chloroform en vervolgens gecentrifugeerd om de waterige en organische fasen in de buis te scheiden. De DNA-bevattende waterfase bovenaan kan dan worden afgepipetteerd, waarbij het eiwit in de organische fase achterblijft.

Zouten worden vaak toegevoegd tijdens DNA-extractie om het DNA te stabiliseren en te helpen het uit de oplossing te precipiteren. Een standaardmethode voor DNA-precipitatie is om ijskoude alcohol, zoals ethanol of isopropanol, aan het monster toe te voegen. Hierdoor vormt het DNA een wit, troebel neerslag in de vloeistof in de buis.

Het monster wordt vervolgens in een centrifuge rondgedraaid, waardoor het DNA-neerslag zich als een pellet op de bodem van de buis verzamelt. De pellet wordt gewassen door de vloeistof te verwijderen, wassen in alcohol, en opnieuw centrifugeren. Na de laatste wasbeurt wordt de pellet opnieuw gesuspendeerd in een buffer, waardoor een waterige oplossing van gezuiverd DNA ontstaat die klaar is om te worden bestudeerd of gebruikt in de biotechnologie.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter