Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.9: DNA-isolatie
INHOUDSOPGAVE

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
DNA-isolatie
 
Deze voice-over is door de computer gegenereerd
TRANSCRIPT
* De tekstvertaling is door de computer gegenereerd

15.9: DNA-isolatie

DNA uit cellen is nodig voor veel biotechnologie- en onderzoekstoepassingen, zoals moleculair klonen. Om DNA uit cellen te verwijderen en te zuiveren, gebruiken onderzoekers verschillende methoden voor DNA-extractie. Hoewel de specifieke kenmerken van verschillende protocollen kunnen variëren, liggen enkele algemene concepten ten grondslag aan het proces van DNA-extractie.

Het proces

Ten eerste moeten cellen worden gelyseerd - opengebroken - om het DNA in oplossing te laten komen. Cellen kunnen fysiek worden gelyseerd met behulp van apparatuur zoals een homogenisator, ultrasoonapparaat of parelklopper, die malen of anderszins kracht uitoefenen om de cellen open te breken. Vaak worden tijdens de lysis stoffen zoals detergentia toegevoegd om de celmembranen op lipidenbasis chemisch te verstoren, waardoor het DNA uit de kern en cel vrijkomt. Door het ronddraaien in een centrifuge wordt het celafval naar de bodem afgezet, en het lysaat - dat cellulaire materialen bevat - wordt verzameld voor verdere verwerking.

Het DNA moet dan worden gescheiden van andere cellulaire moleculen, zoals RNAen eiwitten. Daarom worden enzymen zoals RNase en Proteinase K vaak toegevoegd tijdens of na lysis om respectievelijk RNA en eiwitten af te breken. Bovendien worden organische oplosmiddelen zoals fenol en chloroform vaak gebruikt om DNA van eiwit te scheiden. Typisch wordt het monster gewerveld met fenol-chloroform en vervolgens gecentrifugeerd om de waterige en organische fasen in de buis te scheiden. De DNA-bevattende waterfase bovenaan kan dan worden afgepipetteerd, waarbij het eiwit in de organische fase achterblijft.

Zouten worden vaak toegevoegd tijdens DNA-extractie om het DNA te stabiliseren en te helpen het uit de oplossing te precipiteren. Een standaardmethode voor DNA-precipitatie is om ijskoude alcohol, zoals ethanol of isopropanol, aan het monster toe te voegen. Hierdoor vormt het DNA een wit, troebel neerslag in de vloeistof in de buis.

Het monster wordt vervolgens in een centrifuge rondgedraaid, waardoor het DNA-neerslag zich als een pellet op de bodem van de buis verzamelt. De pellet wordt gewassen door de vloeistof te verwijderen, wassen in alcohol, en opnieuw centrifugeren. Na de laatste wasbeurt wordt de pellet opnieuw gesuspendeerd in een buffer, waardoor een waterige oplossing van gezuiverd DNA ontstaat die klaar is om te worden bestudeerd of gebruikt in de biotechnologie.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter