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15.9: DNA-Isolierung
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PROTOKOLLE

15.9: DNA-Isolierung

DNA aus Zellen wird für viele Anwendungen in der Biotechnologie und Forschung benötigt. Dazu gehört beispielsweise das molekulare Klonen. Um DNA aus Zellen zu extrahieren und zu reinigen, verwenden die Forscher verschiedene Methoden der DNA-Extraktion. Während die Besonderheiten der verschiedenen Protokolle variieren können, liegen dem Prozess der DNA-Extraktion einige allgemeine Konzepte zugrunde.

Der Prozess

Zuerst müssen die Zellen lysiert bzw. aufgebrochen werden, um die DNA in eine Lösung zu bringen. Die Zellen können physisch mit Geräten wie einem Homogenisator, einem Sonikator oder einem Bead-Beater lysiert werden. Hierbei werden die Zellen zermahlen oder auf andere Weise durch Kraft aufgebrochen. Häufig werden während der Lyse Substanzen wie Detergenzien hinzugefügt, um die lipidbasierten Zellmembranen chemisch aufzubrechen. So wird die DNA aus dem Kern und der Zelle freigesetzt. Durch das Schleudern in einer Zentrifuge werden die Zelltrümmer auf dem Boden sedimentiert. Das Lysat, das zelluläre Materialien enthält, wird für die weitere Verarbeitung gesammelt.

Die DNA muss dann von anderen zellulären Molekülen, wie RNA und Proteinen, getrennt werden. Deshalb werden oft Enzyme wie die RNase und Proteinase K während oder nach der Lyse hinzugefügt, um RNA bzw. Proteine abzubauen. Zusätzlich werden häufig organische Lösungsmittel wie Phenol und Chloroform verwendet, um die DNA von den Proteinen zu trennen. Typischerweise wird die Probe mit Phenol-Chloroform verwirbelt und dann zentrifugiert, um die wässrige und organische Phase im Röhrchen zu trennen. Die DNA-haltige wässrige Phase am oberen Ende kann dann abgepipettiert werden, wobei das Protein in der organischen Phase zurückbleibt.

Salze werden oft während der DNA-Extraktion hinzugefügt, um die DNA zu stabilisieren und die Ausfällung aus der Lösung zu unterstützen. Eine Standardmethode der DNA-Präzipitation ist die Zugabe von eiskaltem Alkohol, wie z.B. Ethanol oder Isopropanol. Dadurch bildet die DNA ein weißes, trübes Präzipitat in der Flüssigkeit im Röhrchen.

Die Probe wird dann in einer Zentrifuge geschleudert, wodurch sich das DNA-Präzipitat am Boden des Röhrchens als Pellet sammelt. Die Überreste werden gewaschen, indem die Flüssigkeit entfernt, in Alkohol gewaschen und erneut geschleudert wird. Nach dem letzten Waschschritt wird das Pellet wieder in einem Puffer suspendiert. Dadurch entsteht eine wässrige Lösung von gereinigter DNA, die für Untersuchungen oder die Verwendung in der Biotechnologie verwendet werden kann.

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