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15.9: DNA-Isolierung
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DNA Isolation
 
PROTOKOLLE

15.9: DNA Isolation

15.9: DNA-Isolierung

DNA from cells is required for many biotechnology and research applications, such as molecular cloning. To remove and purify DNA from cells, researchers use various methods of DNA extraction. While the specifics of different protocols may vary, some general concepts underlie the process of DNA extraction.

The Process

First, cells need to be lysed—broken open—to release the DNA into solution. Cells can be physically lysed using equipment such as a homogenizer, sonicator, or bead beater, which grind or otherwise apply force to break the cells open. Often, substances such as detergent are added during lysis to chemically disrupt the lipid-based cell membranes—helping release the DNA from the nucleus and cell. The spinning in a centrifuge sediments the cell debris to the bottom, and the lysate—containing cellular materials—is collected for further processing.

The DNA must then be separated from other cellular molecules, such as RNA and proteins. Therefore, enzymes such as RNase and Proteinase K are often added during or after lysis to degrade RNA and proteins, respectively. Additionally, organic solvents such as phenol and chloroform are commonly used to separate DNA from protein. Typically, the sample is vortexed with phenol-chloroform and then centrifuged to separate the aqueous and organic phases in the tube. The DNA-containing aqueous phase at the top can then be pipetted off, leaving behind the protein in the organic phase.

Salts are often added during DNA extraction to stabilize the DNA and assist in precipitating it out of solution. A standard method of DNA precipitation is to add ice-cold alcohol, such as ethanol or isopropanol, to the sample. This causes the DNA to form a white, cloudy precipitate within the liquid in the tube.

The sample is then spun in a centrifuge, causing the DNA precipitate to collect at the bottom of the tube as a pellet. The pellet is washed by removing the liquid, washing in alcohol, and spinning it again. After the final wash, the pellet is re-suspended in a buffer—creating an aqueous solution of purified DNA that is ready to be studied or used in biotechnology.

DNA aus Zellen wird für viele Anwendungen in der Biotechnologie und Forschung benötigt. Dazu gehört beispielsweise das molekulare Klonen. Um DNA aus Zellen zu extrahieren und zu reinigen, verwenden die Forscher verschiedene Methoden der DNA-Extraktion. Während die Besonderheiten der verschiedenen Protokolle variieren können, liegen dem Prozess der DNA-Extraktion einige allgemeine Konzepte zugrunde.

Der Prozess

Zuerst müssen die Zellen lysiert bzw. aufgebrochen werden, um die DNA in eine Lösung zu bringen. Die Zellen können physisch mit Geräten wie einem Homogenisator, einem Sonikator oder einem Bead-Beater lysiert werden. Hierbei werden die Zellen zermahlen oder auf andere Weise durch Kraft aufgebrochen. Häufig werden während der Lyse Substanzen wie Detergenzien hinzugefügt, um die lipidbasierten Zellmembranen chemisch aufzubrechen. So wird die DNA aus dem Kern und der Zelle freigesetzt. Durch das Schleudern in einer Zentrifuge werden die Zelltrümmer auf dem Boden sedimentiert. Das Lysat, das zelluläre Materialien enthält, wird für die weitere Verarbeitung gesammelt.

Die DNA muss dann von anderen zellulären Molekülen, wie RNA und Proteinen, getrennt werden. Deshalb werden oft Enzyme wie die RNase und Proteinase K während oder nach der Lyse hinzugefügt, um RNA bzw. Proteine abzubauen. Zusätzlich werden häufig organische Lösungsmittel wie Phenol und Chloroform verwendet, um die DNA von den Proteinen zu trennen. Typischerweise wird die Probe mit Phenol-Chloroform verwirbelt und dann zentrifugiert, um die wässrige und organische Phase im Röhrchen zu trennen. Die DNA-haltige wässrige Phase am oberen Ende kann dann abgepipettiert werden, wobei das Protein in der organischen Phase zurückbleibt.

Salze werden oft während der DNA-Extraktion hinzugefügt, um die DNA zu stabilisieren und die Ausfällung aus der Lösung zu unterstützen. Eine Standardmethode der DNA-Präzipitation ist die Zugabe von eiskaltem Alkohol, wie z.B. Ethanol oder Isopropanol. Dadurch bildet die DNA ein weißes, trübes Präzipitat in der Flüssigkeit im Röhrchen.

Die Probe wird dann in einer Zentrifuge geschleudert, wodurch sich das DNA-Präzipitat am Boden des Röhrchens als Pellet sammelt. Die Überreste werden gewaschen, indem die Flüssigkeit entfernt, in Alkohol gewaschen und erneut geschleudert wird. Nach dem letzten Waschschritt wird das Pellet wieder in einem Puffer suspendiert. Dadurch entsteht eine wässrige Lösung von gereinigter DNA, die für Untersuchungen oder die Verwendung in der Biotechnologie verwendet werden kann.

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