15.9: Isolamento del DNA
Il DNA delle cellule è necessario per molte applicazioni biotecnologiche e di ricerca, come la clonazione molecolare. Per rimuovere e purificare il DNA dalle cellule, i ricercatori utilizzano vari metodi di estrazione del DNA. Mentre le specifiche dei diversi protocolli possono variare, alcuni concetti generali sono alla base del processo di estrazione del DNA.
Il processo
In primo luogo, le cellule devono essere lisate -rotte, aperte - per rilasciare il DNA in soluzione. Le cellule possono essere fisicamente lisate utilizzando apparecchiature come un omogeneizzatore, un sonicatore, o battitore , in modo da macinare o altrimenti applicare una forza per rompere le cellule aperte. Spesso, sostanze come il detersivo vengono aggiunte durante la lisi per interrompere chimicamente le membrane cellulari a base di lipidi, aiutando a rilasciare il DNA dal nucleo e dalla cellula. La filatura in una centrifuga sedimenta i detriti cellulari sul fondo e il "lisato", (omogenato) contenente materiali cellulari, viene raccolto per un'ulteriore elaborazione.
Il DNA deve quindi essere separato da altre molecole cellulari, come l'RNA e le proteine. Pertanto, enzimi come RNAsi e Proteinasi K vengono spesso aggiunti durante o dopo la lisi per degradare l'RNA e le proteine, rispettivamente. Inoltre, solventi organici come fenolo e cloroformio sono comunemente utilizzati per separare il DNA dalle proteine. Tipicamente, il campione viene vortexato con fenolo-cloroformio e quindi centrifugato per separare le fasi acquose e organiche nel tubo. La fase acquosa contenente il DNA nella parte superiore può quindi essere convogliata, lasciando dietro di sé la proteina nella fase organica.
I sali vengono spesso aggiunti durante l'estrazione del DNA per stabilizzare il DNA e aiutare a precipitarlo fuori soluzione. Un metodo standard di precipitazione del DNA consiste nell'aggiungere al campione l'alcol ghiacciato, come l'etanolo o l'isopropanolo. Questo fa sì che il DNA formi un precipitato bianco e nuvoloso all'interno del liquido nel tubo.
Il campione viene quindi filato in una centrifuga, causando la raccolta del DNA sul fondo del tubo come un pellet. Il pellet viene lavato rimuovendo il liquido, lavandolo nell'alcool e ruotandolo di nuovo. Dopo il lavaggio finale, il pellet viene ri-sospeso in un buffer, creando una soluzione acquosa di DNA purificato che è pronto per essere studiato o utilizzato nella biotecnologia.
