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15.9: Isolamento de DNA
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DNA Isolation
 
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15.9: DNA Isolation

15.9: Isolamento de DNA

DNA from cells is required for many biotechnology and research applications, such as molecular cloning. To remove and purify DNA from cells, researchers use various methods of DNA extraction. While the specifics of different protocols may vary, some general concepts underlie the process of DNA extraction.

The Process

First, cells need to be lysed—broken open—to release the DNA into solution. Cells can be physically lysed using equipment such as a homogenizer, sonicator, or bead beater, which grind or otherwise apply force to break the cells open. Often, substances such as detergent are added during lysis to chemically disrupt the lipid-based cell membranes—helping release the DNA from the nucleus and cell. The spinning in a centrifuge sediments the cell debris to the bottom, and the lysate—containing cellular materials—is collected for further processing.

The DNA must then be separated from other cellular molecules, such as RNA and proteins. Therefore, enzymes such as RNase and Proteinase K are often added during or after lysis to degrade RNA and proteins, respectively. Additionally, organic solvents such as phenol and chloroform are commonly used to separate DNA from protein. Typically, the sample is vortexed with phenol-chloroform and then centrifuged to separate the aqueous and organic phases in the tube. The DNA-containing aqueous phase at the top can then be pipetted off, leaving behind the protein in the organic phase.

Salts are often added during DNA extraction to stabilize the DNA and assist in precipitating it out of solution. A standard method of DNA precipitation is to add ice-cold alcohol, such as ethanol or isopropanol, to the sample. This causes the DNA to form a white, cloudy precipitate within the liquid in the tube.

The sample is then spun in a centrifuge, causing the DNA precipitate to collect at the bottom of the tube as a pellet. The pellet is washed by removing the liquid, washing in alcohol, and spinning it again. After the final wash, the pellet is re-suspended in a buffer—creating an aqueous solution of purified DNA that is ready to be studied or used in biotechnology.

O DNA das células é necessário para muitas aplicações de biotecnologia e pesquisa, como clonagem molecular. Para remover e purificar o DNA das células, os pesquisadores usam vários métodos de extração de DNA. Embora as especificidades de diferentes protocolos possam variar, alguns conceitos gerais estão por trás do processo de extração de DNA.

O Processo

Primeiro, as células precisam ser abertas — quebradas — para liberar o DNA em solução. As células podem ser fisicamente liseadas usando equipamentos como um homogeneizador, sonicator ou batedor de contas, que moem ou aplicam força para quebrar as células abertas. Muitas vezes, substâncias como detergente são adicionadas durante a lise para interromper quimicamente as membranas celulares baseadas em lipídios — ajudando a liberar o DNA do núcleo e da célula. A fiação em uma centrífuga sedimenta os detritos celulares até o fundo, e o lysate — contendo materiais celulares — é coletado para posterior processamento.

O DNA deve então ser separado de outras moléculas celulares, como RNA e proteínas. Portanto, enzimas como RNase e Proteinase K são frequentemente adicionadas durante ou após a lise para degradar o RNA e as proteínas, respectivamente. Além disso, solventes orgânicos como fenol e clorofórmio são comumente usados para separar o DNA da proteína. Tipicamente, a amostra é vórtice com fenol-clorofórmio e, em seguida, centrifusada para separar as fases aquosas e orgânicas no tubo. A fase aquosa contendo DNA no topo pode então ser pipetada, deixando para trás a proteína na fase orgânica.

Os sais são frequentemente adicionados durante a extração de DNA para estabilizar o DNA e ajudar a precipitar-lo fora de solução. Um método padrão de precipitação de DNA é adicionar álcool gelado, como etanol ou isopropanol, à amostra. Isso faz com que o DNA forme um precipitado branco e nublado dentro do líquido no tubo.

A amostra é então girada em uma centrífuga, fazendo com que o DNA precipitado seja coletado na parte inferior do tubo como uma pelota. A pelota é lavada removendo o líquido, lavando-o em álcool e girando-o novamente. Após a lavagem final, a pelota é reinsumanada em um buffer — criando uma solução aquosa de DNA purificado que está pronto para ser estudado ou usado em biotecnologia.

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