15.9: Isolamento do DNA
O DNA das células é necessário para muitas aplicações de biotecnologia e investigação, como a clonagem molecular. Para remover e purificar o DNA das células, os investigadores usam vários métodos de extração de DNA. Embora as especificidades de diferentes protocolos possam variar, alguns conceitos gerais estão por trás do processo de extração de DNA.
O Processo
Primeiro, as células precisam ser lisadas—abertas—para libertar o DNA em solução. As células podem ser fisicamente lisadas usando equipamentos como um homogeneizador, sonicador ou beadbeater, que moem ou aplicam força para abrir as células. Muitas vezes, substâncias como detergentes são adicionadas durante a lise para romper quimicamente as membranas celulares constituídas por lipídios—ajudando a libertar o DNA do núcleo e da célula. A utilização de uma centrífuga sedimenta os detritos celulares no fundo, e o lisado—contendo materiais celulares—é recolhido para processamento posterior.
O DNA deve então ser separado de outras moléculas celulares, como o RNA e proteínas. Portanto, enzimas como RNase e Proteinase K são frequentemente adicionadas durante ou após a lise para degradar o RNA e as proteínas, respectivamente. Além disso, solventes orgânicos como fenol e clorofórmio são comumente usados para separar o DNA da proteína. Tipicamente, a amostra é vortexada com fenol-clorofórmio e, em seguida, centrifugada para separar as fases aquosas e orgânicas no tubo. A fase aquosa no topo contendo DNA pode então ser pipetada, deixando para trás a proteína na fase orgânica.
Sais são frequentemente adicionados durante a extração de DNA para estabilizar o DNA e ajudar a precipitá-lo da solução. Um método padrão de precipitação de DNA é adicionar álcool gelado, como etanol ou isopropanol, à amostra. Isso faz com que o DNA forme um precipitado branco e nublado dentro do líquido no tubo.
A amostra é então centrifugada, fazendo com que o DNA precipitado se junte na parte inferior do tubo em um pellet. O pellet é lavado por remoção do líquido, lavagem em álcool e nova centrifugação. Após a lavagem final, o pellet é ressuspendido em uma solução tampão—criando uma solução aquosa de DNA purificado que está pronto para ser estudado ou usado em biotecnologia.
