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15.9: Isolement de l'ADN
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Isolement de l'ADN
 
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* La traduction du texte est générée par ordinateur

15.9: Isolement de l'ADN

L’ADN des cellules est nécessaire pour de nombreuses applications de biotechnologie et de recherche, telles que le clonage moléculaire. Pour enlever et purifier l’ADN des cellules, les chercheurs utilisent diverses méthodes d’extraction de l’ADN. Bien que les spécificités des différents protocoles puissent varier, certains concepts généraux sous-tendent le processus d’extraction de l’ADN.

Le processus

Tout d’abord, les cellules doivent être lysées — ouvertes - pour libérer l’ADN dans la solution. Les cellules peuvent être physiquement lysées à l’aide d’équipements tels qu’un homogénéisateur, un sonicateur ou un batteur de perles, qui broient ou appliquent autrement de la force pour briser les cellules ouvertes. Souvent, des substances telles que le détergent sont ajoutées pendant la lyse pour perturber chimiquement les membranes cellulaires à base de lipides, ce qui aide à libérer l’ADN du noyau et de la cellule. La rotation dans une centrifugeuse sédimente les débris cellulaires vers le fond, et le lysate, contenant des matériaux cellulaires, est recueilli pour un traitement ultérieur.

L’ADN doit alors être séparé des autres molécules cellulaires, telles que l’ARN et les protéines. Par conséquent, des enzymes telles que RNase et Proteinase K sont souvent ajoutées pendant ou après la lyse pour dégrader l’ARN et les protéines, respectivement. En outre, les solvants organiques tels que le phénol et le chloroforme sont couramment utilisés pour séparer l’ADN des protéines. Typiquement, l’échantillon est vortexé avec du phénol-chloroforme, puis centrifuge pour séparer les phases aqueuses et organiques dans le tube. La phase aqueuse contenant de l’ADN au sommet peut alors être coupée, laissant derrière elle la protéine dans la phase organique.

Les sels sont souvent ajoutés lors de l’extraction de l’ADN pour stabiliser l’ADN et aider à le précipiter hors de solution. Une méthode standard de précipitation d’ADN consiste à ajouter de l’alcool glacé, comme l’éthanol ou l’isopropanol, à l’échantillon. Cela provoque l’ADN de former un blanc, précipité nuageux dans le liquide dans le tube.

L’échantillon est ensuite filé dans une centrifugeuse, ce qui provoque le précipité de l’ADN à recueillir au fond du tube comme une boulette. Le granulé est lavé en enlevant le liquide, en le lavant dans l’alcool et en le faisant tourner à nouveau. Après le lavage final, la pastille est re-suspendue dans un tampon, créant une solution aqueuse d’ADN purifié qui est prêt à être étudié ou utilisé dans la biotechnologie.

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