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15.9: Isolement de l'ADN
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DNA Isolation
 
TRANSCRIPTION

15.9: DNA Isolation

15.9: Isolement de l'ADN

DNA from cells is required for many biotechnology and research applications, such as molecular cloning. To remove and purify DNA from cells, researchers use various methods of DNA extraction. While the specifics of different protocols may vary, some general concepts underlie the process of DNA extraction.

The Process

First, cells need to be lysed—broken open—to release the DNA into solution. Cells can be physically lysed using equipment such as a homogenizer, sonicator, or bead beater, which grind or otherwise apply force to break the cells open. Often, substances such as detergent are added during lysis to chemically disrupt the lipid-based cell membranes—helping release the DNA from the nucleus and cell. The spinning in a centrifuge sediments the cell debris to the bottom, and the lysate—containing cellular materials—is collected for further processing.

The DNA must then be separated from other cellular molecules, such as RNA and proteins. Therefore, enzymes such as RNase and Proteinase K are often added during or after lysis to degrade RNA and proteins, respectively. Additionally, organic solvents such as phenol and chloroform are commonly used to separate DNA from protein. Typically, the sample is vortexed with phenol-chloroform and then centrifuged to separate the aqueous and organic phases in the tube. The DNA-containing aqueous phase at the top can then be pipetted off, leaving behind the protein in the organic phase.

Salts are often added during DNA extraction to stabilize the DNA and assist in precipitating it out of solution. A standard method of DNA precipitation is to add ice-cold alcohol, such as ethanol or isopropanol, to the sample. This causes the DNA to form a white, cloudy precipitate within the liquid in the tube.

The sample is then spun in a centrifuge, causing the DNA precipitate to collect at the bottom of the tube as a pellet. The pellet is washed by removing the liquid, washing in alcohol, and spinning it again. After the final wash, the pellet is re-suspended in a buffer—creating an aqueous solution of purified DNA that is ready to be studied or used in biotechnology.

L’ADN des cellules est nécessaire pour de nombreuses applications de biotechnologie et de recherche, telles que le clonage moléculaire. Pour enlever et purifier l’ADN des cellules, les chercheurs utilisent diverses méthodes d’extraction de l’ADN. Bien que les spécificités des différents protocoles puissent varier, certains concepts généraux sous-tendent le processus d’extraction de l’ADN.

Le processus

Tout d’abord, les cellules doivent être lysées — ouvertes - pour libérer l’ADN dans la solution. Les cellules peuvent être physiquement lysées à l’aide d’équipements tels qu’un homogénéisateur, un sonicateur ou un batteur de perles, qui broient ou appliquent autrement de la force pour briser les cellules ouvertes. Souvent, des substances telles que le détergent sont ajoutées pendant la lyse pour perturber chimiquement les membranes cellulaires à base de lipides, ce qui aide à libérer l’ADN du noyau et de la cellule. La rotation dans une centrifugeuse sédimente les débris cellulaires vers le fond, et le lysate, contenant des matériaux cellulaires, est recueilli pour un traitement ultérieur.

L’ADN doit alors être séparé des autres molécules cellulaires, telles que l’ARN et les protéines. Par conséquent, des enzymes telles que RNase et Proteinase K sont souvent ajoutées pendant ou après la lyse pour dégrader l’ARN et les protéines, respectivement. En outre, les solvants organiques tels que le phénol et le chloroforme sont couramment utilisés pour séparer l’ADN des protéines. Typiquement, l’échantillon est vortexé avec du phénol-chloroforme, puis centrifuge pour séparer les phases aqueuses et organiques dans le tube. La phase aqueuse contenant de l’ADN au sommet peut alors être coupée, laissant derrière elle la protéine dans la phase organique.

Les sels sont souvent ajoutés lors de l’extraction de l’ADN pour stabiliser l’ADN et aider à le précipiter hors de solution. Une méthode standard de précipitation d’ADN consiste à ajouter de l’alcool glacé, comme l’éthanol ou l’isopropanol, à l’échantillon. Cela provoque l’ADN de former un blanc, précipité nuageux dans le liquide dans le tube.

L’échantillon est ensuite filé dans une centrifugeuse, ce qui provoque le précipité de l’ADN à recueillir au fond du tube comme une boulette. Le granulé est lavé en enlevant le liquide, en le lavant dans l’alcool et en le faisant tourner à nouveau. Après le lavage final, la pastille est re-suspendue dans un tampon, créant une solution aqueuse d’ADN purifié qui est prêt à être étudié ou utilisé dans la biotechnologie.

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