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15.13: ADN complementario
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Complementary DNA
 
TRANSCRIPCIÓN

15.13: Complementary DNA

15.13: ADN complementario

Overview

Only genes that are transcribed into messenger RNA (mRNA) are active, or expressed. Scientists can, therefore, extract the mRNA from cells to study gene expression in different cells and tissues. The scientist converts mRNA into complementary DNA (cDNA) via reverse transcription. Because mRNA does not contain introns (non-coding regions) and other regulatory sequences, cDNA—unlike genomic DNA—also allows researchers to directly determine the amino acid sequence of the peptide encoded by the gene.

cDNA Synthesis

cDNA can be generated by several methods, but a common way is to first extract total RNA from cells, and then isolate the mRNA from the more predominant types—transfer RNA (tRNA) and ribosomal (rRNA). Mature eukaryotic mRNA has a poly(A) tail—a string of adenine nucleotides—added to its 3’ end, while other types of RNA do not. Therefore, a string of thymine nucleotides (oligo-dTs) can be attached to a substrate such as a column or magnetic beads, to specifically base-pair with the poly(A) tails of mRNA. While mRNA with a poly(A) tail is captured, the other types of RNA are washed away.

Next, reverse transcriptase—a DNA polymerase enzyme from retroviruses—is used to generate cDNA from the mRNA. Since, like most DNA polymerases, reverse transcriptase can add nucleotides only to the 3’ end of a chain, a poly(T) primer is added to bind to the poly(A) tail to provide a starting point for cDNA synthesis. The cDNA strand ends in a hairpin loop. The RNA is then degraded—commonly with alkali treatment or RNase enzymes—leaving the single-stranded cDNA intact.

A second DNA strand complementary to the cDNA is then synthesized by DNA polymerase—often using the hairpin loop of the first cDNA strand or a nicked piece of the mRNA as a primer.

The resulting double-stranded cDNA can be inserted into bacterial or viral vectors and cloned using standard molecular biology techniques. A cDNA library—representing all the mRNAs in the cells or tissue of interest—can also be constructed for additional research.

Visión general

Solo los genes que se transcriben en ARN mensajero (ARNm) son activos o expresados. Por lo tanto, los científicos pueden extraer el ARNm de las células para estudiar la expresión génica en diferentes células y tejidos. El científico convierte el ARNm en ADN complementario (ADNC) a través de la transcripción inversa. Debido a que el ARNm no contiene intrones (regiones no codificantes) y otras secuencias reglamentarias, el ADNC, a diferencia del ADN genómico, también permite a los investigadores determinar directamente la secuencia de aminoácidos del péptido codificado por el gen.

Síntesis de ADNc

El ADNc se puede generar por varios métodos, pero una forma común es extraer primero el ARN total de las células, y luego aislar el ARNm de los tipos más predominantes: ARN de transferencia (ARN) y ribosomal (ARN). El ARNm eucariota maduro tiene una cola poli(A), una cadena de nucleótidos de adenina, añadida a su extremo de 3', mientras que otros tipos de ARN no. Por lo tanto, una cadena de nucleótidos de timina (oligo-dTs) se puede unir a un sustrato como una columna o cuentas magnéticas, para emparejar específicamente la base con las colas de poli(A) de ARNm. Mientras se captura el ARNm con una cola de poli(A), los otros tipos de ARN se lavan.

A continuación, la transcriptasa inversa, una enzima de la polimerasa de ADN de retrovirus, se utiliza para generar ADNc a partir del ARNm. Dado que, como la mayoría de las polimerasas de ADN, la transcriptasa inversa puede añadir nucleótidos sólo al extremo de 3' de una cadena, se añade una imprimación de poli(T) para unirse a la cola de poli(A) para proporcionar un punto de partida para la síntesis de ADNc. La hebra de ADNc termina en un lazo de horquilla. El ARN se degrada, comúnmente con el tratamiento alcalés o las enzimas RNase, dejando intacto el ADNr de una sola cadena.

Una segunda cadena de ADN complementaria al ADNc es sintetizada por ADN polimerasa, a menudo usando el lazo de horquilla de la primera hebra de ADNn. o una pieza de ARNm como imprimación.

El ADNn a doble cadena resultante se puede insertar en vectores bacterianos o virales y clonarse utilizando técnicas de biología molecular estándar. También se puede construir una biblioteca de ADNC, que representa todos los mRNAs en las células o el tejido de interés, para realizar investigaciones adicionales.


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