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15.13: ADN complémentaire
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Complementary DNA
 
TRANSCRIPTION

15.13: Complementary DNA

15.13: ADN complémentaire

Overview

Only genes that are transcribed into messenger RNA (mRNA) are active, or expressed. Scientists can, therefore, extract the mRNA from cells to study gene expression in different cells and tissues. The scientist converts mRNA into complementary DNA (cDNA) via reverse transcription. Because mRNA does not contain introns (non-coding regions) and other regulatory sequences, cDNA—unlike genomic DNA—also allows researchers to directly determine the amino acid sequence of the peptide encoded by the gene.

cDNA Synthesis

cDNA can be generated by several methods, but a common way is to first extract total RNA from cells, and then isolate the mRNA from the more predominant types—transfer RNA (tRNA) and ribosomal (rRNA). Mature eukaryotic mRNA has a poly(A) tail—a string of adenine nucleotides—added to its 3’ end, while other types of RNA do not. Therefore, a string of thymine nucleotides (oligo-dTs) can be attached to a substrate such as a column or magnetic beads, to specifically base-pair with the poly(A) tails of mRNA. While mRNA with a poly(A) tail is captured, the other types of RNA are washed away.

Next, reverse transcriptase—a DNA polymerase enzyme from retroviruses—is used to generate cDNA from the mRNA. Since, like most DNA polymerases, reverse transcriptase can add nucleotides only to the 3’ end of a chain, a poly(T) primer is added to bind to the poly(A) tail to provide a starting point for cDNA synthesis. The cDNA strand ends in a hairpin loop. The RNA is then degraded—commonly with alkali treatment or RNase enzymes—leaving the single-stranded cDNA intact.

A second DNA strand complementary to the cDNA is then synthesized by DNA polymerase—often using the hairpin loop of the first cDNA strand or a nicked piece of the mRNA as a primer.

The resulting double-stranded cDNA can be inserted into bacterial or viral vectors and cloned using standard molecular biology techniques. A cDNA library—representing all the mRNAs in the cells or tissue of interest—can also be constructed for additional research.

Aperçu

Seuls les gènes transcrits en ARN messager (ARNm) sont actifs ou exprimés. Les scientifiques peuvent donc extraire l’ARNm des cellules pour étudier l’expression des gènes dans différentes cellules et tissus. Le scientifique convertit l’ARNm en ADN complémentaire (ADNC) par transcription inversée. Étant donné que l’ARNm ne contient pas d’introns (régions non codantes) et d’autres séquences réglementaires, l’ADNC , contrairement à l’ADN génomique, permet également aux chercheurs de déterminer directement la séquence d’acides aminés du peptide codé par le gène.

Synthèse de l’ADNC

l’ADD peut être générée par plusieurs méthodes, mais une manière commune est d’extraire d’abord l’ARN total des cellules, puis d’isoler l’ARNm des types plus prédominants — l’ARN de transfert (ARnt t) et le ribosomal (rRNA). L’ARNm eucaryote mature a une queue poly(A) — une chaîne de nucléotides d’adénine — ajoutée à son extrémité de 3', alors que d’autres types d’ARN ne le font pas. Par conséquent, une chaîne de nucléotides de thymine (oligo-dTs) peut être attachée à un substrat tel qu’une colonne ou des perles magnétiques, pour spécifiquement base-paire avec les queues poly(A) de l’ARNm. Alors que l’ARNm avec une queue poly(A) est capturé, les autres types d’ARN sont emportés.

Ensuite, la transcriptase inverse — une enzyme de polymérase d’ADN des rétrovirus — est utilisée pour générer l’ADNC à partir de l’ARNm. Puisque, comme la plupart des polymérases d’ADN, la transcriptase inverse ne peut ajouter des nucléotides qu’à l’extrémité de 3' d’une chaîne, une amorce poly(T) est ajoutée pour se lier à la queue poly(A) pour fournir un point de départ pour la synthèse de l’ADC. Le brin d’ADC se termine en boucle d’épingle à cheveux. L’ARN est alors dégradé , généralement avec le traitement alcalin ou les enzymes RNase - laissant l’ADC à brin unique intact.

Un deuxième brin d’ADN complémentaire à l’ADNC est ensuite synthétisé par la polymérase de l’ADN , souvent à l’aide de la boucle d’épingle à cheveux du premier brin d’ADNic ou d’un morceau entaillé de l’ARNm comme amorce.

L’ADNC à double brin qui en résulte peut être inséré dans des vecteurs bactériens ou viraux et cloné à l’aide de techniques de biologie moléculaire standard. Une bibliothèque de l’ADC — représentant tous les ARNm dans les cellules ou les tissus d’intérêt — peut également être construite pour des recherches supplémentaires.


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