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15.13: ADN complémentaire
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ADN complémentaire
 
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15.13: ADN complémentaire

Aperçu

Seuls les gènes transcrits en ARN messager (ARNm) sont actifs ou exprimés. Les scientifiques peuvent donc extraire l’ARNm des cellules pour étudier l’expression des gènes dans différentes cellules et tissus. Le scientifique convertit l’ARNm en ADN complémentaire (ADNC) par transcription inversée. Étant donné que l’ARNm ne contient pas d’introns (régions non codantes) et d’autres séquences réglementaires, l’ADNC , contrairement à l’ADN génomique, permet également aux chercheurs de déterminer directement la séquence d’acides aminés du peptide codé par le gène.

Synthèse de l’ADNC

l’ADD peut être générée par plusieurs méthodes, mais une manière commune est d’extraire d’abord l’ARN total des cellules, puis d’isoler l’ARNm des types plus prédominants — l’ARN de transfert (ARnt t) et le ribosomal (rRNA). L’ARNm eucaryote mature a une queue poly(A) — une chaîne de nucléotides d’adénine — ajoutée à son extrémité de 3', alors que d’autres types d’ARN ne le font pas. Par conséquent, une chaîne de nucléotides de thymine (oligo-dTs) peut être attachée à un substrat tel qu’une colonne ou des perles magnétiques, pour spécifiquement base-paire avec les queues poly(A) de l’ARNm. Alors que l’ARNm avec une queue poly(A) est capturé, les autres types d’ARN sont emportés.

Ensuite, la transcriptase inverse — une enzyme de polymérase d’ADN des rétrovirus — est utilisée pour générer l’ADNC à partir de l’ARNm. Puisque, comme la plupart des polymérases d’ADN, la transcriptase inverse ne peut ajouter des nucléotides qu’à l’extrémité de 3' d’une chaîne, une amorce poly(T) est ajoutée pour se lier à la queue poly(A) pour fournir un point de départ pour la synthèse de l’ADC. Le brin d’ADC se termine en boucle d’épingle à cheveux. L’ARN est alors dégradé , généralement avec le traitement alcalin ou les enzymes RNase - laissant l’ADC à brin unique intact.

Un deuxième brin d’ADN complémentaire à l’ADNC est ensuite synthétisé par la polymérase de l’ADN , souvent à l’aide de la boucle d’épingle à cheveux du premier brin d’ADNic ou d’un morceau entaillé de l’ARNm comme amorce.

L’ADNC à double brin qui en résulte peut être inséré dans des vecteurs bactériens ou viraux et cloné à l’aide de techniques de biologie moléculaire standard. Une bibliothèque de l’ADC — représentant tous les ARNm dans les cellules ou les tissus d’intérêt — peut également être construite pour des recherches supplémentaires.


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