Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.13: Complementair DNA
INHOUDSOPGAVE

JoVE Core
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. You will only be able to see the first 20 seconds.

Education
Complementair DNA
 
Deze voice-over is door de computer gegenereerd
TRANSCRIPT
* De tekstvertaling is door de computer gegenereerd

15.13: Complementair DNA

Overzicht

Alleen genen die worden getranscribeerd in boodschapper-RNA (mRNA) zijn actief of tot expressie gebracht. Wetenschappers kunnen daarom het mRNA uit cellen extraheren om genexpressie in verschillende cellen en weefsels te bestuderen. De wetenschapper zet mRNA om in complementair DNA (cDNA) via reverse transcriptie. Omdat mRNA geen introns (niet-coderende regio's) en andere regulerende sequenties bevat, stelt cDNA - in tegenstelling tot genomisch DNA - onderzoekers ook in staat om direct de aminozuursequentie te bepalen van het peptide dat door het gen wordt gecodeerd.

cDNA-synthese

cDNA kan op verschillende manieren worden gegenereerd, maar een gebruikelijke manier is om eerst totaal RNA uit cellen te extraheren en vervolgens het mRNA te isoleren van de meer overheersende typen: transfer-RNA (tRNA) en ribosomaal (rRNA). Rijp eukaryoot mRNA heeft een poly (A) -staart - een reeks adeninenucleotiden - toegevoegd aan het 3'-uiteinde, terwijl andere soorten RNA dat niet doen. Daarom kan een reeks thyminenucleotiden (oligo-dT's) aan een su worden bevestigdbstrate zoals een kolom of magnetische kralen, specifiek basenpaar met de poly (A) staarten van mRNA. Terwijl mRNA met een poly (A) -staart wordt gevangen, worden de andere soorten RNA weggespoeld.

Vervolgens wordt reverse transcriptase - een DNA-polymerase-enzym uit retrovirussen - gebruikt om cDNA uit het mRNA te genereren. Omdat, zoals de meeste DNA-polymerasen, reverse transcriptase nucleotiden alleen aan het 3'-uiteinde van een keten kan toevoegen, wordt een poly (T) -primer toegevoegd om te binden aan de poly (A) -staart om een startpunt te bieden voor cDNA-synthese. De cDNA-streng eindigt in een haarspeldlus. Het RNA wordt vervolgens afgebroken - gewoonlijk met alkalibehandeling of RNase-enzymen - waardoor het enkelstrengige cDNA intact blijft.

Een tweede DNA-streng complementair aan het cDNA wordt vervolgens gesynthetiseerd door DNA-polymerase - vaak met gebruikmaking van de haarspeldlus van de eerste cDNA-streng of een gekerfd stuk van het mRNA als primer.

Het resulterende dubbelstrengs cDNA kan in bacteriële of virale vectoren worden ingevoegd en met behulp vanstandaard moleculaire biologietechnieken. Een cDNA-bibliotheek - die alle mRNA's in de cellen of weefsels van interesse vertegenwoordigt - kan ook worden geconstrueerd voor aanvullend onderzoek.


Aanbevolen Lectuur

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter