15.13: Complementary DNA
15.13: Complementair DNA
Overview
Only genes that are transcribed into messenger RNA (mRNA) are active, or expressed. Scientists can, therefore, extract the mRNA from cells to study gene expression in different cells and tissues. The scientist converts mRNA into complementary DNA (cDNA) via reverse transcription. Because mRNA does not contain introns (non-coding regions) and other regulatory sequences, cDNA—unlike genomic DNA—also allows researchers to directly determine the amino acid sequence of the peptide encoded by the gene.
cDNA Synthesis
cDNA can be generated by several methods, but a common way is to first extract total RNA from cells, and then isolate the mRNA from the more predominant types—transfer RNA (tRNA) and ribosomal (rRNA). Mature eukaryotic mRNA has a poly(A) tail—a string of adenine nucleotides—added to its 3’ end, while other types of RNA do not. Therefore, a string of thymine nucleotides (oligo-dTs) can be attached to a substrate such as a column or magnetic beads, to specifically base-pair with the poly(A) tails of mRNA. While mRNA with a poly(A) tail is captured, the other types of RNA are washed away.
Next, reverse transcriptase—a DNA polymerase enzyme from retroviruses—is used to generate cDNA from the mRNA. Since, like most DNA polymerases, reverse transcriptase can add nucleotides only to the 3’ end of a chain, a poly(T) primer is added to bind to the poly(A) tail to provide a starting point for cDNA synthesis. The cDNA strand ends in a hairpin loop. The RNA is then degraded—commonly with alkali treatment or RNase enzymes—leaving the single-stranded cDNA intact.
A second DNA strand complementary to the cDNA is then synthesized by DNA polymerase—often using the hairpin loop of the first cDNA strand or a nicked piece of the mRNA as a primer.
The resulting double-stranded cDNA can be inserted into bacterial or viral vectors and cloned using standard molecular biology techniques. A cDNA library—representing all the mRNAs in the cells or tissue of interest—can also be constructed for additional research.
Overzicht
Alleen genen die worden getranscribeerd in boodschapper-RNA (mRNA) zijn actief of tot expressie gebracht. Wetenschappers kunnen daarom het mRNA uit cellen extraheren om genexpressie in verschillende cellen en weefsels te bestuderen. De wetenschapper zet mRNA om in complementair DNA (cDNA) via reverse transcriptie. Omdat mRNA geen introns (niet-coderende regio's) en andere regulerende sequenties bevat, stelt cDNA - in tegenstelling tot genomisch DNA - onderzoekers ook in staat om direct de aminozuursequentie te bepalen van het peptide dat door het gen wordt gecodeerd.
cDNA-synthese
cDNA kan op verschillende manieren worden gegenereerd, maar een gebruikelijke manier is om eerst totaal RNA uit cellen te extraheren en vervolgens het mRNA te isoleren van de meer overheersende typen: transfer-RNA (tRNA) en ribosomaal (rRNA). Rijp eukaryoot mRNA heeft een poly (A) -staart - een reeks adeninenucleotiden - toegevoegd aan het 3'-uiteinde, terwijl andere soorten RNA dat niet doen. Daarom kan een reeks thyminenucleotiden (oligo-dT's) aan een su worden bevestigdbstrate zoals een kolom of magnetische kralen, specifiek basenpaar met de poly (A) staarten van mRNA. Terwijl mRNA met een poly (A) -staart wordt gevangen, worden de andere soorten RNA weggespoeld.
Vervolgens wordt reverse transcriptase - een DNA-polymerase-enzym uit retrovirussen - gebruikt om cDNA uit het mRNA te genereren. Omdat, zoals de meeste DNA-polymerasen, reverse transcriptase nucleotiden alleen aan het 3'-uiteinde van een keten kan toevoegen, wordt een poly (T) -primer toegevoegd om te binden aan de poly (A) -staart om een startpunt te bieden voor cDNA-synthese. De cDNA-streng eindigt in een haarspeldlus. Het RNA wordt vervolgens afgebroken - gewoonlijk met alkalibehandeling of RNase-enzymen - waardoor het enkelstrengige cDNA intact blijft.
Een tweede DNA-streng complementair aan het cDNA wordt vervolgens gesynthetiseerd door DNA-polymerase - vaak met gebruikmaking van de haarspeldlus van de eerste cDNA-streng of een gekerfd stuk van het mRNA als primer.
Het resulterende dubbelstrengs cDNA kan in bacteriële of virale vectoren worden ingevoegd en met behulp vanstandaard moleculaire biologietechnieken. Een cDNA-bibliotheek - die alle mRNA's in de cellen of weefsels van interesse vertegenwoordigt - kan ook worden geconstrueerd voor aanvullend onderzoek.
CH
DE