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15.13: DNA Complementar
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Complementary DNA
 
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15.13: Complementary DNA

15.13: DNA Complementar

Overview

Only genes that are transcribed into messenger RNA (mRNA) are active, or expressed. Scientists can, therefore, extract the mRNA from cells to study gene expression in different cells and tissues. The scientist converts mRNA into complementary DNA (cDNA) via reverse transcription. Because mRNA does not contain introns (non-coding regions) and other regulatory sequences, cDNA—unlike genomic DNA—also allows researchers to directly determine the amino acid sequence of the peptide encoded by the gene.

cDNA Synthesis

cDNA can be generated by several methods, but a common way is to first extract total RNA from cells, and then isolate the mRNA from the more predominant types—transfer RNA (tRNA) and ribosomal (rRNA). Mature eukaryotic mRNA has a poly(A) tail—a string of adenine nucleotides—added to its 3’ end, while other types of RNA do not. Therefore, a string of thymine nucleotides (oligo-dTs) can be attached to a substrate such as a column or magnetic beads, to specifically base-pair with the poly(A) tails of mRNA. While mRNA with a poly(A) tail is captured, the other types of RNA are washed away.

Next, reverse transcriptase—a DNA polymerase enzyme from retroviruses—is used to generate cDNA from the mRNA. Since, like most DNA polymerases, reverse transcriptase can add nucleotides only to the 3’ end of a chain, a poly(T) primer is added to bind to the poly(A) tail to provide a starting point for cDNA synthesis. The cDNA strand ends in a hairpin loop. The RNA is then degraded—commonly with alkali treatment or RNase enzymes—leaving the single-stranded cDNA intact.

A second DNA strand complementary to the cDNA is then synthesized by DNA polymerase—often using the hairpin loop of the first cDNA strand or a nicked piece of the mRNA as a primer.

The resulting double-stranded cDNA can be inserted into bacterial or viral vectors and cloned using standard molecular biology techniques. A cDNA library—representing all the mRNAs in the cells or tissue of interest—can also be constructed for additional research.

Visão geral

Apenas genes que são transcritos em RNA mensageiro (mRNA) estão ativos ou expressos. Os cientistas podem, portanto, extrair o mRNA das células para estudar a expressão genética em diferentes células e tecidos. O cientista converte mRNA em DNA complementar (cDNA) via transcrição reversa. Como o mRNA não contém introns (regiões não codificadas) e outras sequências regulatórias, o CDNA — ao contrário do DNA genômico — também permite que os pesquisadores determinem diretamente a sequência de aminoácidos do peptídeo codificado pelo gene.

Síntese cDNA

cDNA pode ser gerado por vários métodos, mas uma maneira comum é primeiro extrair RNA total das células e, em seguida, isolar o mRNA dos tipos mais predominantes — transferir RNA (tRNA) e ribossômico (rRNA). O mRNA eucariótico maduro tem uma cauda poli(A) — uma sequência de nucleotídeos de adenina — adicionado ao seu final de 3', enquanto outros tipos de RNA não. Portanto, uma cadeia de nucleotídeos de timina (oligo-dTs) pode ser anexada a um substrato, como uma coluna ou contas magnéticas, para especificamente basear-se com as caudas poli(A) de mRNA. Enquanto o mRNA com uma cauda poli(A) é capturado, os outros tipos de RNA são lavados.

Em seguida, a transcriptase reversa — uma enzima de polimerase de DNA a partir de retrovírus — é usada para gerar cDNA a partir do mRNA. Uma vez que, como a maioria das polimerases de DNA, a transcriptase reversa pode adicionar nucleotídeos apenas à extremidade de 3' de uma cadeia, um primer poli(T) é adicionado para se ligar à cauda poli(A) para fornecer um ponto de partida para a síntese de CDNA. O fio cDNA termina em um laço de grampo de cabelo. O RNA é então degradado — comumente com tratamento alcalino ou enzimas RNase — deixando o CDNA de uma única cadeia intacto.

Um segundo fio de DNA complementar ao cDNA é então sintetizado pela polimerase de DNA — muitas vezes usando o laço de grampo de cabelo do primeiro fio cDNA ou um pedaço cortado do mRNA como uma cartilha.

O CDNA de dupla cadeia resultante pode ser inserido em vetores bacterianos ou virais e clonado usando técnicas de biologia molecular padrão. Uma biblioteca cDNA — representando todos os mRNAs nas células ou tecidos de interesse — também pode ser construída para pesquisas adicionais.


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