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15.13: 互补DNA
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15.13: 互补DNA

“只有转录成信使RNA(mRNA)的基因才是活跃的或表达的。因此,科学家可以从细胞中提取mRNA来研究不同细胞和组织中的基因表达。科学家通过反转录将mRNA转化为互补DNA(cDNA)。由于mRNA不包含内含子(非编码区)和其他调控序列,cDNA与基因组DNA不同,它还允许研究人员直接确定由基因编码的肽的氨基酸序列。”

cDNA合成

cDNA可以通过多种方法产生,但通常的方法是首先从细胞中提取总RNA,然后从更为主要的类型; 转移RNA(tRNA)和核糖体(rRNA)中分离mRNA。成熟的真核生物mRNA有一个多聚(A)尾,即在其3末端添加一系列腺嘌呤核苷酸,而其他类型的RNA则没有。因此,一系列胸腺嘧啶核苷酸(oligo-dTs) 可以附着在诸如柱或磁珠之类的底物上,特别是与mRNA的多(A)尾碱基对。当带有聚 (A) 尾的mRNA被捕获时,其他类型的RNA被冲走。

接下来,逆转录酶是一种来自逆转录病毒的DNA聚合酶,用于从mRNA中生成cDNA 。由于与大多数DNA聚合酶一样,逆转录酶只能将核苷酸添加到链的3端,因此添加 poly(T)引物以结合(A)尾以提供cDNA合成的起点。 cDNA链以发夹环结尾。然后,RNA被降解,通常用碱处理或 RNAse 酶处理,使单链cDNA保持完整。

与cDNA互补的第二条DNA链随后由DNA聚合酶合成,通常使用第一条cDNA链的发夹环或mRNA的缺口片段作为引物。

由此产生的双链cDNA可以插入到细菌或病毒载体中,并使用标准的分子生物学技术进行克隆。还可以构建一个cDNA文库,代表兴趣的细胞或组织中的所有mRNA,以供进一步研究。


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