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15.13: Komplementäre DNA
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Complementary DNA
 
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15.13: Complementary DNA

15.13: Komplementäre DNA

Overview

Only genes that are transcribed into messenger RNA (mRNA) are active, or expressed. Scientists can, therefore, extract the mRNA from cells to study gene expression in different cells and tissues. The scientist converts mRNA into complementary DNA (cDNA) via reverse transcription. Because mRNA does not contain introns (non-coding regions) and other regulatory sequences, cDNA—unlike genomic DNA—also allows researchers to directly determine the amino acid sequence of the peptide encoded by the gene.

cDNA Synthesis

cDNA can be generated by several methods, but a common way is to first extract total RNA from cells, and then isolate the mRNA from the more predominant types—transfer RNA (tRNA) and ribosomal (rRNA). Mature eukaryotic mRNA has a poly(A) tail—a string of adenine nucleotides—added to its 3’ end, while other types of RNA do not. Therefore, a string of thymine nucleotides (oligo-dTs) can be attached to a substrate such as a column or magnetic beads, to specifically base-pair with the poly(A) tails of mRNA. While mRNA with a poly(A) tail is captured, the other types of RNA are washed away.

Next, reverse transcriptase—a DNA polymerase enzyme from retroviruses—is used to generate cDNA from the mRNA. Since, like most DNA polymerases, reverse transcriptase can add nucleotides only to the 3’ end of a chain, a poly(T) primer is added to bind to the poly(A) tail to provide a starting point for cDNA synthesis. The cDNA strand ends in a hairpin loop. The RNA is then degraded—commonly with alkali treatment or RNase enzymes—leaving the single-stranded cDNA intact.

A second DNA strand complementary to the cDNA is then synthesized by DNA polymerase—often using the hairpin loop of the first cDNA strand or a nicked piece of the mRNA as a primer.

The resulting double-stranded cDNA can be inserted into bacterial or viral vectors and cloned using standard molecular biology techniques. A cDNA library—representing all the mRNAs in the cells or tissue of interest—can also be constructed for additional research.

Überblick

Nur Gene, die in Boten-RNAs (mRNA) transkribiert werden, sind aktiv oder werden exprimiert. Wissenschaftler können daher die mRNA aus Zellen extrahieren, um die Genexpression in verschiedenen Zellen und Geweben zu untersuchen. So kann ein Wissenschaftler die mRNA über die reverse Transkription in komplementäre DNA (cDNA) umwandeln. Da die mRNA keine Introns (nicht-kodierende Regionen) und andere regulatorische Sequenzen enthält, erlaubt die cDNAauch die direkte Bestimmung der Aminosäuresequenz des vom Gen kodierten Peptids. Dies ist bei der —im genomischen DANN nicht möglich.

Die cDNA-Synthese

cDNA kann durch verschiedene Methoden erzeugt werden. Der gewöhnliche Weg ist jedoch, zuerst die Gesamt-RNA aus den Zellen zu extrahieren und dann die mRNA aus den vorherrschenden Typen zu isolieren. Es werden Transfer-RNA (tRNA) und ribosomale (rRNA) übertragen. Reife eukaryontische mRNA hat einen poly(A)-Schwanz. Dies ist ein String von Adenin-Nucleotiden, der an ihr 3’ Ende hinzugefügt ist. Andere RNA-Typen besitzen diesen nicht. Daher kann ein String von Thymin-Nucleotiden (Oligo-dTs) an ein Substrat wie eine Säule oder magnetische Beads angehängt werden, um spezifisch mit den poly(A)-Schwänzen der mRNA ein Basenpaar zu bilden. Während mRNA mit einem poly(A)-Schwanz gefangen wird, werden die anderen RNA-Typen weggewaschen.

Als nächstes wird die reverse Transkriptase verwendet, um aus der mRNA cDNA zu generieren. Die reverse Transkriptase ist ein DNA-Polymerase-Enzym aus Retroviren. Da die reverse Transkriptase, wie die meisten DNA-Polymerasen, Nucleotide nur an das 3’ Ende einer Kette binden kann, wird ein Poly(T)-Primer hinzugefügt. Dieser bindet sich an den Poly(A)-Schwanz, um einen Startpunkt für die cDNA-Synthese zur Verfügung zu stellen. Der cDNA-Strang endet in einer Haarnadelschleife. Die RNA wird dann abgebaut. Dies geschieht üblicherweise durch eine Alkalibehandlung oder RNase-Enzymen. Dabei bleibt die einzelsträngige cDNA intakt.

Ein zweiter, zur cDNA komplementärer DNA-Strang wird dann durch DNA-Polymerase synthetisiert. Dies findet oft unter Verwendung der Haarnadelschleife des ersten cDNA-Stranges oder eines eingekerbten Stückes der mRNA als Primer statt.

Die resultierende doppelsträngige cDNA kann in bakterielle oder virale Vektoren eingefügt und mit den üblichen molekularbiologischen Techniken geklont werden. Eine cDNA-Bibliothek, welche alle mRNAs in den interessierenden Zellen oder Geweben darstellt, kann auch für zusätzliche Forschung konstruiert werden.


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