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15.13: Komplementäre DNA
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PROTOKOLLE

15.13: Komplementäre DNA

Überblick

Nur Gene, die in Boten-RNAs (mRNA) transkribiert werden, sind aktiv oder werden exprimiert. Wissenschaftler können daher die mRNA aus Zellen extrahieren, um die Genexpression in verschiedenen Zellen und Geweben zu untersuchen. So kann ein Wissenschaftler die mRNA über die reverse Transkription in komplementäre DNA (cDNA) umwandeln. Da die mRNA keine Introns (nicht-kodierende Regionen) und andere regulatorische Sequenzen enthält, erlaubt die cDNAauch die direkte Bestimmung der Aminosäuresequenz des vom Gen kodierten Peptids. Dies ist bei der —im genomischen DANN nicht möglich.

Die cDNA-Synthese

cDNA kann durch verschiedene Methoden erzeugt werden. Der gewöhnliche Weg ist jedoch, zuerst die Gesamt-RNA aus den Zellen zu extrahieren und dann die mRNA aus den vorherrschenden Typen zu isolieren. Es werden Transfer-RNA (tRNA) und ribosomale (rRNA) übertragen. Reife eukaryontische mRNA hat einen poly(A)-Schwanz. Dies ist ein String von Adenin-Nucleotiden, der an ihr 3’ Ende hinzugefügt ist. Andere RNA-Typen besitzen diesen nicht. Daher kann ein String von Thymin-Nucleotiden (Oligo-dTs) an ein Substrat wie eine Säule oder magnetische Beads angehängt werden, um spezifisch mit den poly(A)-Schwänzen der mRNA ein Basenpaar zu bilden. Während mRNA mit einem poly(A)-Schwanz gefangen wird, werden die anderen RNA-Typen weggewaschen.

Als nächstes wird die reverse Transkriptase verwendet, um aus der mRNA cDNA zu generieren. Die reverse Transkriptase ist ein DNA-Polymerase-Enzym aus Retroviren. Da die reverse Transkriptase, wie die meisten DNA-Polymerasen, Nucleotide nur an das 3’ Ende einer Kette binden kann, wird ein Poly(T)-Primer hinzugefügt. Dieser bindet sich an den Poly(A)-Schwanz, um einen Startpunkt für die cDNA-Synthese zur Verfügung zu stellen. Der cDNA-Strang endet in einer Haarnadelschleife. Die RNA wird dann abgebaut. Dies geschieht üblicherweise durch eine Alkalibehandlung oder RNase-Enzymen. Dabei bleibt die einzelsträngige cDNA intakt.

Ein zweiter, zur cDNA komplementärer DNA-Strang wird dann durch DNA-Polymerase synthetisiert. Dies findet oft unter Verwendung der Haarnadelschleife des ersten cDNA-Stranges oder eines eingekerbten Stückes der mRNA als Primer statt.

Die resultierende doppelsträngige cDNA kann in bakterielle oder virale Vektoren eingefügt und mit den üblichen molekularbiologischen Techniken geklont werden. Eine cDNA-Bibliothek, welche alle mRNAs in den interessierenden Zellen oder Geweben darstellt, kann auch für zusätzliche Forschung konstruiert werden.


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