15.14: PCR
Visão Geral
A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica amplamente utilizada para copiar segmentos de DNA. Devido a amplificação exponencial, o PCR pode produzir milhões ou biliões de cópias de DNA em apenas algumas horas. Em uma reação de PCR, uma enzima DNA polimerase resistente ao calor amplifica o DNA original através de uma série de alterações de temperatura dentro de uma máquina automatizada chamada termociclador.
O PCR é um Método Versátil que Revolucionou a Biologia Molecular
Kary Mullis desenvolveu o PCR em 1983, pelo qual recebeu o Prémio Nobel da Química em 1993. Sendo uma maneira relativamente rápida, barata e precisa de copiar uma sequência de DNA, o PCR tornou-se uma ferramenta inestimável para inúmeras aplicações, incluindo clonagem molecular, mutagénese genética, detecção de angentes patogénicos, análise de expressão genética, quantificação e sequenciamento de DNA e diagnóstico de doenças genéticas.
O Ciclo de Reação do PCR
O PCR imita o processo natural de replicação do DNA que ocorre nas células. A mistura da reação inclui uma sequência de DNA molde a ser copiada, um par de moléculas de DNA curtas chamadas primers, blocos de construção de DNA livres chamados deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), e uma enzima DNA polimerase especializada.
O PCR envolve uma série de passos a altas temperaturas, exigindo uma enzima DNA polimerase que seja funcional a tais temperaturas. A DNA polimerase mais usada é a Taq polimerase, nomeada em homenagem a Thermus aquaticus, a bactéria da qual a polimerase foi inicialmente isolada. A DNA polimerase é incapaz de sintetizar uma molécula de DNA do zero, ou de novo. Em vez disso, a DNA polimerase complementa moléculas de DNA curtas, chamadas primers, que se ligam ao molde de DNA através do emparelhamento complementar de bases. Os primers fornecem um grupo hidroxilo 3’ livre ao qual a DNA polimerase pode anexar novos dNTPs. Existem quatro tipos de dNTPs em um PCR, um para cada nucleótido na molécula de DNA: dATP, dCTP, dGTP e dTTP.
Cada ciclo de PCR consiste em três passos: Desnaturação, Anelamento e Síntese de DNA.
- Desnaturação. O ciclo de PCR é iniciado aquecendo a mistura de reação a uma alta temperatura, causando a separação da dupla hélice do DNA em duas cadeias. Este processo de “fusão” geralmente ocorre a uma temperatura de 90°C–100°C.
- Anelamento. A mistura de reação é rapidamente arrefecida (geralmente para 50°C–65°C), permitindo que os dois primers se liguem às suas sequências complementares nas cadeias de DNA do molde.
- Síntese de DNA (Extensão de Primers). A mistura de reação é aquecida novamente, desta vez a uma temperatura (geralmente 60°C–75°C) que permite que a DNA polimerase estenda os primers adicionando dNTPs que emparelham com as bases da cadeia molde.
Um PCR típico envolve 20-40 ciclos repetidos desses três passos, que ocorrem no termociclador. Como o número de moléculas de DNA é duplicado em cada ciclo, o DNA é amplificado exponencialmente.
Limitações do PCR
Se o cientista quiser amplificar uma porção específica do genoma, o cientista deve saber pelo menos parte da sequência de DNA alvo para criar primers apropriados. Outro problema potencial é o anelamento não específico de primers a sequências de DNA parcialmente semelhantes, levando à amplificação de DNA não alvo. Este problema pode ser controlado optimizando as condições da reação. Sendo um método de detecção altamente sensível, o PCR também é vulnerável a contaminação, e até mesmo vestígios de DNA contaminante podem originar resultados enganadores. As DNA polimerases usados no PCR podem ser propensas a erros. Se uma mutação acontecer nos primeiros ciclos, a maior parte do DNA amplificado carregará a mutação.
