15.14: La PCR
Visión general
La reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, es una técnica ampliamente utilizada para copiar segmentos de ADN. Debido a la amplificación exponencial, la PCR puede producir millones o miles de millones de copias de ADN en pocas horas. En una reacción PCR, una enzima de la polimerasa de ADN resistente al calor amplifica el ADN original a través de una serie de cambios de temperatura dentro de una máquina automatizada llamada termociclador.
LA PCR es un método versátil que revolucionó la biología molecular
Kary Mullis desarrolló la PCR en 1983, por la que fue galardonado con el Premio Nobel de Química 1993. Al ser una forma relativamente rápida, económica y precisa de copiar una secuencia de ADN, la PCR se convirtió en una herramienta invaluable para numerosas aplicaciones, incluyendo la clonación molecular, la mutagénesis génica, la detección de patógenos, el análisis de la expresión génica, la cuantificación y secuenciación del ADN, y el diagnóstico de enfermedades genéticas.
El ciclo de reacción de la PCR
La PCR imita el proceso natural de replicación del ADN que ocurre en las células. La mezcla de reacción incluye una secuencia de ADN de plantilla para copiar, un par de moléculas cortas de ADN llamadas imprimaciones, bloques de construcción de ADN libres llamados trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTPs) y una enzima especializada en la polimerasa del ADN.
La PCR implica una serie de pasos a altas temperaturas, que requieren una enzima de la polimerasa del ADN que sea funcional a tales temperaturas. La polimerasa de ADN más utilizada es La polimerasa Taq, llamada así por Thermus aquaticus,la bacteria de la que se aisló inicialmente la polimerasa. La polimerasa del ADN es incapaz de sintetizar una molécula de ADN desde cero, o de novo. En su lugar, la polimerasa del ADN se suma a moléculas de ADN cortas, llamadas imprimaciones, que se unen a la plantilla de ADN a través del emparejamiento base complementario.Las imprimaciones proporcionan un grupo hidroxilo gratuito de 3' al que la polimerasa de ADN puede adjuntar nuevos dNTPs. Hay cuatro tipos de dNTPs en una PCR, uno para cada nucleótido en la molécula de ADN: dATP, dCTP, dGTP y dTTP.
Cada ciclo de PCR consta de tres pasos: Desnaturalización, Recocido y Síntesis de ADN.
- Desnaturalización. El ciclo de PCR se inicia calentando la mezcla de reacción a una temperatura alta, causando la separación de la doble hélice del ADN en dos hebras. Este proceso de "fusión" generalmente ocurre a una temperatura de 90 oC a 100 oC.
- Recocido. La mezcla de reacción se enfría rápidamente (generalmente a 50 oC a 65 oC), lo que permite que las dos imprimaciones se unan a sus secuencias complementarias en las hebras de ADN de la plantilla.
- Síntesis de ADN (Primer Extension). La mezcla de reacción se calienta de nuevo, esta vez a una temperatura (generalmente de 60 oC a 75 oC) que permite que la polimerasa de ADN extienda las imprimaciones mediante la adición de dNTP que se emparejan con las bases en la cadena de la plantilla.
Un PCR típico implica 20-40 ciclos repetidos de estos tres pasos, que ocurren en el termociclador. Dado que el número de moléculas de ADN se duplica en cada ciclo, el ADN se amplifica exponencialmente.
Limitaciones de la PCR
Si el científico quiere amplificar un tramo específico del genoma, el científico debe conocer al menos parte de la secuencia de ADN diana para diseñar imprimaciones apropiadas. Otro problema potencial es el recocido inespecífico de imprimaciones a secuencias de ADN parcialmente similares, lo que conduce a la amplificación del ADN no objetivo. Este problema se puede controlar optimizando las condiciones de reacción. Al ser un método de detección altamente sensible, la PCR también es vulnerable a la contaminación, e incluso las cantidades traza de ADN contaminante pueden causar resultados engañosos. Las polimerasas de ADN utilizadas en la PCR pueden ser propensas a errores. Si una mutación ocurre dentro de los primeros ciclos, la mayor parte del ADN amplificado llevará la mutación.
