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15.14: PCR
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15.14: PCR

“聚合酶链式反应(PCR)是一种广泛应用的复制DNA片段的技术。由于指数扩增,PCR可以在几个小时内产生数百万或数十亿个DNA拷贝。在PCR反应中,一种耐热的DNA聚合酶通过一种叫做热循环器的自动机器内的一系列温度变化放大原始DNA。”

聚合酶链反应是一种多功能的方法,它使分子生物学发生了革命性的变化。

Kary Mullis于1983年发展了PCR技术,并因此获得1993年诺贝尔化学奖。PCR作为一种相对快速、廉价、精确的复制DNA序列的方法,在分子克隆、基因突变、病原体检测、基因表达分析、DNA定量测序、遗传病诊断等领域具有重要的应用价值。

PCR反应周期

PCR模拟了细胞中自然的DNA复制过程。反应混合物包括要复制的模板DNA序列、一对短DNA分子(称为引物)、称为脱氧核苷酸三磷酸 (dNTPs)的游离DNA构建基和一种专门的DNA聚合酶。

PCR需要在高温下进行一系列步骤,需要在这种温度下发挥作用的DNA聚合酶酶。最常用的DNA聚合酶是 Taq 聚合酶,以最初分离聚合酶的细菌 Thermus aquaticus 命名。DNA聚合酶不能从头合成DNA分子。取而代之的是,DNA聚合酶加入称为引物的短DNA分子,通过互补碱基配对与DNA模板结合。这些引物提供了一个自由的3羟基,DNA聚合酶可以将新的dNTPs连接到这个羟基上。在PCR中有四种类型的dNTPs,DNA分子中的每个核苷酸对应一种:dATP, dCTP, dGTP和dTTP。

每个PCR循环包括三个步骤:变性、退火和DNA合成。

  1. 变性。PCR循环是通过将反应混合物加热到高温开始的,从而将DNA双螺旋分离为两股。这种“熔化”过程通常发生在90-100摄氏度的温度下。
  2. 退火。反应混合物迅速冷却(通常冷却到50-65摄氏度),使两个引物结合到模板DNA链上的互补序列上。
  3. DNA合成(引物延伸)。再次加热反应混合物,这一次加热温度(通常为60-75摄氏度),允许DNA聚合酶通过添加与模板链中的碱基配对的dNTPs来扩展引物。

典型的聚合酶链反应包括这三个步骤的20-40个重复周期,发生在热循环器中。由于DNA分子的数量在每个周期中加倍,DNA被指数放大。

聚合酶链反应的局限性

如果科学家想要扩增基因组的特定片段,科学家必须至少知道目标DNA序列的一部分才能设计出合适的引物。另一个潜在的问题是引物对部分相似DNA序列的非特异性退火,导致非靶DNA扩增。这个问题可以通过优化反应条件来控制。PCR作为一种高度敏感的检测方法,也容易受到污染,甚至微量的污染DNA也会造成误导性的结果。聚合酶链反应中使用的DNA聚合酶很容易出错。如果突变发生在最初的几个周期内,大多数扩增的DNA都会携带突变。


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