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15.14: PCR
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PCR
 
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15.14: PCR

Aperçu

La réaction en chaîne de polymérase, ou PCR, est une technique largement utilisée pour copier des segments d’ADN. En raison de l’amplification exponentielle, PCR peut produire des millions ou des milliards de copies d’ADN en quelques heures. Dans une réaction pcr, une enzyme de polymérase d’ADN résistant à la chaleur amplifie l’ADN original par une série de changements de température à l’intérieur d’une machine automatisée appelée thermocycler.

PCR est une méthode polyvalente qui a révolutionné la biologie moléculaire

Kary Mullis a développé pcr en 1983, pour lequel il a reçu le prix Nobel de chimie 1993. Étant un moyen relativement rapide, peu coûteux et précis de copier une séquence d’ADN, le PCR est devenu un outil précieux pour de nombreuses applications, y compris le clonage moléculaire, la mutagenèse des gènes, la détection des agents pathogènes, l’analyse de l’expression génique, la quantitation et le séquençage de l’ADN, et le diagnostic des maladies génétiques.

Le cycle de réaction pcr

PcR imite le processus naturel de réplication de l’ADN qui se produit dans les cellules. Le mélange de réaction comprend une séquence d’ADN de modèle à copier, une paire de molécules d’ADN courtes appelées amorces, des blocs de construction d’ADN libres appelés triphosphates de désoxynucléotide (dNTPs), et une enzyme spécialisée de polymérase d’ADN.

PcR implique une série d’étapes à des températures élevées, nécessitant une enzyme de polymérase d’ADN qui est fonctionnelle à de telles températures. La polymérase d’ADN la plus couramment utilisée est la polymérase de Taq, du nom de Thermus aquaticus, la bactérie à partir de laquelle la polymérase a été initialement isolée. La polymérase d’ADN est incapable de synthétiser une molécule d’ADN à partir de zéro, ou de novo. Au lieu de cela, la polymérase de l’ADN ajoute aux molécules d’ADN courtes, appelées amorces, qui se lient au modèle d’ADN par l’appariement de base complémentaire. Les amorces fournissent un groupe d’hydroxyle gratuit de 3' auquel la polymérase d’ADN peut attacher de nouveaux dNTP. Il existe quatre types de dNTP dans un PCR, un pour chaque nucléotide dans la molécule d’ADN : dATP, dCTP, dGTP et dTTP.

Chaque cycle pcr se compose de trois étapes : la dénaturation, l’anneaux et la synthèse de l’ADN.

  1. Dénaturation. Le cycle PCR est initié par le chauffage du mélange de réaction à une température élevée, provoquant la séparation de l’ADN double hélice en deux brins. Ce processus de « fusion » se produit habituellement à une température de 90°C–100°C.
  2. Recuit. Le mélange de réaction est rapidement refroidi (habituellement à 50°C–65°C), permettant aux deux amorces de se lier à leurs séquences complémentaires sur les brins d’ADN de modèle.
  3. Synthèse d’ADN (Extension d’amorce). Le mélange de réaction est chauffé à nouveau, cette fois à une température (habituellement 60°C–75°C) qui permet à la polymérase d’ADN d’étendre les amorces en ajoutant des dNTP qui s’associent aux bases du brin de modèle.

Un PCR typique implique 20-40 cycles répétés de ces trois étapes, se produisant dans le thermocycler. Puisque le nombre de molécules d’ADN est doublé dans chaque cycle, l’ADN est amplifié de façon exponentielle.

Limitations du PCR

Si le scientifique veut amplifier un tronçon spécifique du génome, le scientifique doit connaître au moins une partie de la séquence d’ADN cible pour concevoir des amorces appropriées. Un autre problème potentiel est l’énalisation non spécifique des amorces à des séquences d’ADN partiellement similaires, conduisant à l’amplification de l’ADN non-cible. Ce problème peut être contrôlé en optimisant les conditions de réaction. Étant une méthode de détection très sensible, pcr est également vulnérable à la contamination, et même des traces d’ADN contaminant peut causer des résultats trompeurs. Les polymérases d’ADN utilisées dans pcr peuvent être sujettes à des erreurs. Si une mutation se produit dans les premiers cycles, la plupart de l’ADN amplifié portera la mutation.


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