Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

15.14: PCR
INHALTSVERZEICHNIS

Your institution must subscribe to JoVE's JoVE Core collection to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

PROTOKOLLE

15.14: PCR

Überblick

Die Polymerase-Kettenreaktion (PKR) ist eine weit verbreitete Technik zum Kopieren von DNA-Abschnitten. Aufgrund der exponentiellen Amplifikation kann die PKR innerhalb weniger Stunden Millionen oder Milliarden von DNA-Kopien herstellen. In einer PKR-Reaktion amplifiziert ein hitzebeständiges DNA-Polymerase-Enzym die ursprüngliche DNA durch eine Reihe von Temperaturänderungen in einem Automaten. Diesen bezeichnet man als Thermocycler.

PKR ist eine vielseitige Methode, durch welche die Molekularbiologie revolutioniert wurde

Kary Mullis entwickelte die PKR im Jahr 1983. Dafür erhielt er im Jahr 1993 auch den Nobelpreis für Chemie. Als relativ schnelle, kostengünstige und präzise Methode zum Kopieren einer DNA-Sequenz wurde PKR zu einem unschätzbaren Werkzeug für zahlreiche Anwendungen. Dazu gehören beispielsweise das molekulare Klonen, die Genmutagenese, der Nachweis von Krankheitserregern, die Analyse der Genexpression, die Quantifizierung und Sequenzierung der DNA sowie die Diagnose genetischer Krankheiten.

Der PKR-Reaktionszyklus

PKR ahmt den natürlichen DNA-Replikationsprozess nach, der in den Zellen abläuft. Das Reaktionsgemisch enthält eine zu kopierende Template-DNA-Sequenz. Es handelt sich um ein Paar kurzer DNA-Moleküle, die Primer genannt werden, freie DNA-Bausteine, die Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs) genannt werden, und ein spezialisiertes DNA-Polymerase-Enzym.

PKR umfasst eine Reihe von Schritten bei hohen Temperaturen. Daher wird ein DNA-Polymerase-Enzym gebraucht, das auch bei solchen Temperaturen funktionsfähig ist. Die am häufigsten verwendete DNA-Polymerase ist Taq-Polymerase, benannt nach Thermus aquaticus, dem Bakterium, aus dem die Polymerase ursprünglich isoliert wurde. Die DNA-Polymerase ist nicht dazu in der Lage, ein DNA-Molekül von Grund auf oder neu zu synthetisieren. Stattdessen fügt die DNA-Polymerase kurze DNA-Moleküle, sogenannte Primer, hinzu. Diese binden sich durch komplementäre Basenpaarung an die DNA-Vorlage. Die Primer liefern eine freie 3’ Hydroxylgruppe, an welche die DNA-Polymerase neue dNTPs binden kann. Es gibt vier Arten von dNTPs in einer PKR, einen für jedes Nukleotid im DNA-Molekül: dATP, dCTP, dGTP und dTTP.

Der PKR-Zyklus besteht aus drei Schritten: Denaturierung, Annealing und DNA-Synthese.

  1. Denaturierung. Der PKR-Zyklus wird durch Erhitzen des Reaktionsgemisches auf eine hohe Temperatur gestartet. Dabei wird die DNA-Doppelhelix in zwei Stränge aufgetrennt. Dieser “Schmelz”-Prozess findet normalerweise bei Temperatuenr zwischen 90°C–100°C statt.
  2. Annealing. Das Reaktionsgemisch wird schnell abgekühlt (normalerweise auf 50°C–65°C, wodurch die beiden Primer an ihre komplementären Sequenzen auf den Template-DNA-Strängen binden können.
  3. DNA-Synthese (Primer-Verlängerung). Das Reaktionsgemisch wird erneut erhitzt, diesmal auf eine Temperatur (normalerweise 60°C–75°C, die es der DNA-Polymerase erlaubt, die Primer durch Zugabe von dNTPs, die sich mit den Basen im Template-Strang paaren, zu verlängern.

Eine typische PKR beinhaltet 20-40 wiederholte Zyklen dieser drei Schritte, die im Thermocycler stattfinden. Da sich die Anzahl der DNA-Moleküle in jedem Zyklus verdoppelt, wird die DNA exponentiell vervielfältigt.

Grenzen der PKR-Methode

Wenn eini Wissenschaftler einen bestimmten Abschnitt des Genoms amplifizieren will, muss er zumindest einen Teil der Ziel-DNA-Sequenz kennen, um einen geeigneten Primer zu entwerfen. Ein weiteres potenzielles Problem ist die unspezifische Annelierung von Primern an teilweise ähnliche DNA-Sequenzen. Das führt zur Amplifikation von Nicht-Ziel-DNA. Dieses Problem lässt sich durch die Optimierung der Reaktionsbedingungen kontrollieren. Da die PKR eine hochempfindliche Nachweismethode ist, ist sie auch anfällig für Kontaminationen. Selbst Spuren kontaminierender DNA können zu irreführenden Ergebnissen führen. Die in der PKR verwendeten DNA-Polymerasen können fehleranfällig sein. Kommt es innerhalb der ersten Zyklen zu einer Mutation, trägt der größte Teil der amplifizierten DNA diese Mutation.


Suggested Reading

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter