Einführung in die Spektralphotometrie

General Laboratory Techniques

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Summary

Das Spektralphotometer ist ein häufig benutztes Laborinstrument in der wissenschaftlichen Forschung. Spektralphotometrie ist die quantitative Messung von wieviel Licht von einer chemischen Substanz absorbiert wird, indem ein Lichtstrahl mit Hilfe eines Spektralphotometers durch eine Probe gestrahlt wird.

In diesem Video wiederholen wir die grundlegenden Konzepte der Spektralphotometrie, einschließlich von Durchlässigkeit, Absorbanz, dem Lambert-Beer’schen Gesetz und der Bestandteile des Spektralphotometers. Diese Konzepte bilden das Grundgerüst zur Ermittlung der Konzentration eines Stoffes in Lösung, der Licht im UV oder sichtbarem Bereich absorbiert. Außerdem zeigen wir, wie man Spektralphotometer bedient, einschließlich davon wie man einen Blindwert misst und wie die Absorbanz einer gewünschten Wellenlänge von einer Probe ermittelt wird. Dieses Video beinhaltet auch wie man eine Standardkurve für die Bestimmung von Konzentrationen herstellt. Mehrere Anwendungen des Spektralphotometers in der biologischen Forschung werden vorgestellt, zum Beispiel das Messen der Zelldichte und dem Bestimmen von chemischen Reaktionsraten. Zu letzt führen wir Mikrovolumenspektralphotometer ein, die dazu nützlich sind, um die Quantität und Qualität von Proteinen und Nukleinsäuren zu bestimmen.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Generelle Laborverfahren. Einführung in die Spektralphotometrie. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Ein Spektralphotometer ist ein Laborgerät, das in biologischen, chemischen, klinischen und Umweltlabors häufig benutzt wird.

Spektralphotometrie ist die quantitative Messung von wieviel Licht eine chemische Substanz absorbiert, indem ein Lichtstrahl mit Hilfe eines Spektralphotometers durch die Probe gestrahlt wird.

Durch das Messen der austretenden Lichtintensität, kann diese Methode verwendet werden, um die Konzentrationen von Stoffen in Proben zu bestimmen.

Der Lichtstrahl, der in Richtung der Probe gestrahlt wird, besteht aus Photonen.

Wenn Photonen auf Moleküle in der Probe treffen, werden einige der einstrahlenden Photonen durch diese Moleküle absorbiert. Das verringert die Anzahl der Photonen im austretenden Licht und führt zu einem verringertem Signal.

Die Durchlässigkeit ist der Teil des Lichts der durch die Probe durchgeht und ist als die Intensität des austretenden Lichts geteilt durch die Intensität des einfallenden Lichts definiert. Absorbanz ist der umgekehrte Logarithmus der Durchlässigkeit und ist das, was von dem Spektralphotometer gemessen wird.

Ausgehend von der Absorbanz kann die Konzentration der Probe durch Anwendung des Lambert-Beer’schen Gesetzes bestimmt werden, das besagt das ein lineares Verhältnis zwischen der Absorbanz und der Konzentration der Probe besteht. Laut dem Lambert-Beer’schen Gesetzes ist die Absorbanz das Produkt des Extinktionskoeffizienten (einer Maßeinheit dafür wie stark ein gelöster Stoff Licht einer bestimmten Wellenlänge absorbiert), der Länge des Lichts das durch die Probe geht (auch Pfadlänge genannt), und der Konzentration des gelösten Stoffes. Das Ziel einer Absorbanzmessung ist meist das Bestimmen der Konzentration einer Probe.

Jedes Spektralphotometer besteht aus einer Lichtquelle, einem Kollimator (also einer Linse oder einem Fokusiergerät, das einen intensiven Lichstrahl ausstrahlt), einem Monochromator um das Licht in seine Wellenlängenbestandteile aufzutrennen, und einem Wellenlängenselektor (oder Spalt), um die geeignete Wellenlänge auszusuchen. Die Wellenlängen, die in diesem Video behandelt werden, sind im UV und im sichtbaren Bereich. Das Spektralphotometer beinhaltet auch eine Probenhalterung, einen Photodetektor, und einen Bildschirm, um das Ergebnis anzuzeigen.

Neuere Spektralphotometer sind direkt an einen Computer angeschlossen, an dem die Parameter eingestellt und die Ergebnisse abgelesen werden können.

Beim Benutzen eines Spektralphotometers sollte man abhängig von den biologischen und chemischen Lösungen mit denen man arbeitet die nötigen Vorsichtsmaßnahmen treffen, wie zum Beispiel das Tragen von Handschuhen.

Vor der Messung des UV-sichtbaren Spektrums einer Probe, muss man die Maschine anschalten und warten bis die Lampen aufgewärmt sind.

Nun stellt man einen Blindwert ohne den zu analysierenden Stoff her, der den gleichen pH-Wert und die gleiche Ionenkonzentration des Lösungsmittels hat. Das ist ein notwendiger Schritt, da die Küvette und das Lösungsmittel selbst Licht absorbieren.

Traditionelle Spektralphotometer sind so konzipiert, das sie Plastik und Quarzküvetten halten können. Nun pipettiert man die Blindlösung in die Küvette.

Nachdem man eventuelle Fingerabdrücke durch Abwischen entfernt hat, platziert man die Küvette in die vorgesehene Halterung und schießt die Tür zu dem Küvettenabteil.

Man sollte nie vergessen die Tür zu schließen, da UV-Strahlung von einem offenen Spektralphotometer Haut und Augen beschädigen kann.

Nun sucht man den gewünschten Wellenlängenbereich aus, der auf die Probe gestrahlt werden soll, abhängig von der optimalen Wellenlänge, die von der Probe absorbiert wird. Danach wird das Instrument durch Lesen des Blindwerts auf 0 gestellt, was die Hintergrundabsorbanz von der Absorbanz der Probe abzieht.

Abhängig von der Art des Spektralphotometer Experiments das ausgeführt wird, kann es sein das man eine Standardkurve vor der Probenmessung durchführt, von der die Konzentrationen der Probe errechnet werden kann.

Nun sollte man die Probe bis zur angemessenen Temperatur aufwärmen und sie vorsichtig mischen, damit sich keine Luftblasen bilden. Die Probe kann dann direkt in die Küvette in dem Instrument pipettiert und der Messwert bestimmt werden.

Nach der Messung der Absorbanz der Probe führt man die Berechnung für das Experiment aus, zum Beispiel zum Bestimmen der Konzentration oder der Zerfallsrate der Aktivität eines Enzyms.

Das Spektralphotometer wird in den meisten Forschungslabors so gut wie täglich benutzt.

Eine häufige Anwendung von Spektralphotometern ist das Messen von Zelldichten. Zelldichtemessungen sind nützlich um logarithmische Wachstumskurven für Bakterien zu bestimmen, von der die optimale Zeit für die Induktion der Expression von Proteinen bestimmt werden kann.

Das Spektralphotometer kann außerdem verwendet werden, um die Raten von chemischen Reaktionen zu messen. In diesem Beispiel wird die Absorbanz genutzt um eine enzymatische Reaktion zu beobachten, bei der sich ein Zwischenprodukt auflöst, das Licht mit 452 nm absorbiert. Die Rate der enzymatischen Reaktion kann dann unter Einbeziehung der geeigneten Gleichung berechnet werden.

Die Einführung von Mikrovolumenspektralphotometern haben Probenhalterungen überflüssig gemacht. Solche Spektralphotometer benutzen Oberflächenspannung um die Proben zu fassen.

Mikrovolumenspektralphotometer sind optimal um die Qualität und Konzentration von teuren Proben mit kleinen Volumen zu messen, zum Beispiel von biologischen Molekülen wie Proteinen und Nukleinsäuren.

Die Absorbanz eines Proteins bei 280 nm ist abhängig von der Anzahl der aromatischen Seitenketten, zum Beispiel in den Aminosäuren Tryptophan, Tyrosin und Phenylalanin, und auch davon ob Cystein Brücken in dem Protein enthalten sind.

Proteinkonzentrationen können von ihrerer Absorbanz bei 280 nm und von ihrem Extinktionskoeffizienten, der abhängig von der Aminosäurenkomposition ist. bestimmt werden.

Sowohl DNA als auch RNA absorbieren Licht mit einem Maximum bei 260 nm, wovon die Konzentration bestimmt werden kann. Die Reinheit der Probe kann durch das Verhältnis der Absorbanz bei verschiedenen Wellenlängen bestimmt werden.

Das war die Einführung in die Spektralphotometrie von JoVE. In diesem Video haben wir die grundlegenden Prinzipien, einschließlich der Grundlagen der Spektralphotometrie und der Bestandteile eines Spektralphotometers wiederholt. Wir haben außerdem eine Schritt-für-Schritt Anleitung für die Benutzung eines Spektralphotometers gegeben und Anwendungen behandelt.

Danke für eure Aufmerksamkeit.

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