制备组织学样品用于光学显微镜技术

General Laboratory Techniques

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Summary

组织学是指对细胞和组织的研究,它通常需要借助于光学显微镜。根据样品本身属性如大小,硬度以及处理后使用的染色技术和下游应用的不同,制备组织学样品的过程也会有很大不同。如本视频中介绍的,样品的制备通常是从固定步骤开始,用以防止濒临死亡细胞所释放出的酶对样品的降解。固定后,样品会被置于包埋试剂来使样品完全被支撑起来。最常用的是石蜡,但是其他的一些试剂,例如含甘油的冷冻试剂和琼脂也可以在切片的时候用于包埋样品。然后在切片机或其他切片仪器中将样品切割成厚度为几微米到几毫米的薄片。切片之后,薄片会被固定在载玻片上,根据需要进行染色以获得特定的标记,而后在显微镜下成像。

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JoVE Science Education Database. 常用的实验室技术. 制备组织学样品用于光学显微镜技术. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

组织学这一术语是指对组织和细胞显微结构的研究。正确地制备用于光学显微镜技术的组织学样品对于从组织样品中得到高质量的结果至关重要。

几乎所有的组织学操作过程都有三个主要步骤。第一,固定样品,这是为了保存组织并减缓组织降解过程。第二,将样品浸没于包埋试剂中,这种试剂具有和组织相似的机械性能。第三,包埋之后,样品将被切片,也就是被一种称为切片机的精确切片工具切成薄片。本视频将讲述这些常规步骤以及与它们相关的一些概念。

组织固定是非常重要的步骤,能够保持细胞和组织成分并保持它们原来的结构。细胞死亡后,自然产生的酶从细胞器中释放,开始降解用来保持细胞和周围组织的结构完整性的细胞内和细胞外的蛋白质。固定步骤能够通过抑制这些酶降解蛋白质以及掩盖酶的作用位点使其不被识别来防止降解的发生。

固定的两个主要机制是交联作用和凝结作用。交联作用涉及到在蛋白质内部和蛋白质之间共价键的形成,他使得组织硬化从而抵抗降解。凝结作用是指使用化学溶剂,例如酒精,对蛋白质进行脱水,使得蛋白质的三维结构变形,从而蛋白质的疏水区域会转移到表面。凝结固定可以帮助包埋试剂如石蜡,渗入到组织内部。

最常用的固定试剂之一是福尔马林,由甲醛溶于水得到。固定过程中,甲醛连接到伯胺上,也就是位于氨基酸亮氨酸和谷氨酸侧链上的胺基团。它们之间形成称为亚甲桥的稳定交联。这个过程进行缓慢,会持续1到2天。

在固定之前需要考虑几个问题。第一,样品的扩散能力。固定试剂在组织内会以一定的速率扩散一定的距离,该速率与固定试剂的扩散系数乘以时间的平方根相关。如果一个固定试剂渗入样品1毫米需要1小时,那么它渗入5毫米则需要25小时。当福尔马林到达组织样品中心后还需要一定的时间来发生交联反应。因此,样品的厚度应该被限制在4毫米以内,来保证在适当的时间内可以达到完全地固定。

第二,要考虑固定试剂的体积和pH值。固定试剂和样品的体积比应该至少有40:1,这样试剂不会随着时间而被耗尽。有些固定试剂需要在酸性pH条件下作用,而福尔马林的最好作用条件是向其中加入磷酸盐缓冲液来维持中性pH,这样不会产生多余的酸而造成组织中的假象结果 。

组织学样品制备的第二步是包埋,是指将样品支撑起来,所用的试剂要与样品本身有相似的机械强度。选择合适的包埋试剂非常重要,因为过强或者过软都有可能在切片过程造成瑕疵。迄今为止,最常用的包埋试剂是石蜡。

在石蜡包埋之前,样品必须脱水,即先用乙醇取代组织中的水分,然后是二甲苯,最后是预热的石蜡。当石蜡浸入到样品后,小心地加入更多的石蜡来使样品在模具上固定并支撑起来,形成样品模块。下一步则是将样品置于组织盒中用于切片。

切片是指将样品从一个包埋好的模块切成薄片的过程。用于光学显微镜的切片通常厚度为4到10微米。

准备切片时,先在切片机上固定好一个金属的、玻璃的、或钻石的刀片。然后将样品放入样品池。接下来,样品被移动到切割刀面并沿着刀片划过,得到一个理想厚度的切片。切片样品会形成薄带状,可将其放置于载玻片上。

对于石蜡包埋的样品,薄片要先放入预热的水浴中,然后将其从水中捞出放在载玻片上晾干。

生物样品本身的对比性很小,因此组织切片通常需要使用染料或抗体来染色突出细胞的形态或某些特定蛋白质。最常用的染料是苏木精和伊红,也称H&E。因为使用普遍,目前已经有许多全自动仪器可以重复性对大量的切片进行染色。苏木精可以将细胞核染成蓝色,伊红可以将细胞质染成粉红色。这样可以显示出组织的细胞学形态。

固定的一个缺陷是蛋白质的交联会使得标记抗体更难找到其结合位点。因此可不用固定来保存样品,而是将组织快速冷冻,或称急冻法,之后样品会被用于冷冻切片技术来切片。

在这个方法中,组织样品被包埋和放置在一种特殊的冷冻试剂,称为优化切割温度试剂OCT,然后被快速冷冻。和其他的包埋试剂一样,OCT与样品的机械强度相同。

低温冷冻切片机用于切割冷冻切片。这种仪器的内部温度一般为-20度来保持刀片和样品冷冻。与石蜡包埋切片不同,冷冻切片得到的切片可以立刻被直接放到带正电荷的载玻片上。

另一种可省略固定步骤的方法是琼脂包埋法,这里样品会被新鲜制备的液态琼脂糖所覆盖。一旦琼脂糖冷却,组织就被固定在原位,多余的琼脂糖可以被除去。

震荡切片机,另一种类型的切片机,它的刀片可以震动并穿过琼脂糖包埋的样品。震荡切片机用于从琼脂糖包埋的样品上切割厚度为50到1000微米的切片。

染色前,通常将样品从琼脂糖中取出,然后放置在载玻片上,并加入真空润滑脂一类的物质以避免盖玻片压碎样品。为了对每个厚切片都得到高分辨率的图像,这些切片最好使用共聚焦显微镜来观察。

您刚观看的是JoVE关于如何为光学显微镜技术制备组织学样品的短片。现在您应该了解了怎样从一块组织制备可染色的切片样品的整个步骤。我们一如既往地感谢您的观看。

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