Preparación de muestras histológicas para microscopía de luz

General Laboratory Techniques

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Summary

La histología es el estudio de células y tejidos, que normalmente es ayudado por el uso de un microscopio de luz. La preparación de muestras histológicas puede variar considerablemente basado en las propiedades inherentes de las muestras como el tamaño y dureza así como esperado de post-tratamiento que incluye previsto técnicas de coloración u otras aplicaciones de flujo de abajo. Como se describe en este video, preparacion comienza típicamente con un procedimiento de fijación para evitar la degradación de la muestra por natural las enzimas que son liberadas por las células a la muerte. Una vez fijadas, las muestras se colocan en un medio de inclusión que es capaz de soportar suficientemente la muestra. Comúnmente se trata de cera de parafina, pero otros materiales como una glicerina basan medio de congelación y agares también se utilizan para rodear la muestra durante el seccionamiento. Secciones entonces lleva a cabo en un micrótomo u otro dispositivo de corte que le permite afeitarse la muestra en rodajas desde unas micras hasta unos milímetros de espesor. Una vez cortadas, secciones son montadas en un portaobjetos de vidrio y teñidas para llevar a cabo funciones específicas de la muestra antes de ser reflejada en un microscopio.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Técnicas generales de laboratorio. Preparación de muestras histológicas para microscopía de luz. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La histología es un término que se refiere al estudio de la anatomía microscópica de células y tejidos. Adecuada preparación histológica para microscopía de luz es esencial para obtener resultados de calidad de las muestras de tejido.

Hay 3 pasos principales comunes a casi todos los procedimientos histológicos. En primer lugar, la muestra es fija, con el fin de preservar el tejido y retrasar la degradación de tejido. A continuación, la muestra se encuentra inmerso en un material o medio de inclusión, que tiene propiedades mecánicas similares a sí mismo. Una vez encajado, la muestra es seccionada o cortada en rodajas con una herramienta de corte preciso conocida como un micrótomo. Este video describe los pasos generales y algunos de los conceptos que se relacionan con ellos.

La fijación del tejido es un paso crítico que conserva componentes de células y tejidos y mantiene su estructura. Tras la muerte de la célula, naturalmente enzimas que se liberan de organelos celulares y comienzan a degradar las proteínas en la célula y la matriz extracelular, destruyendo así la estructura de la célula. Fijación impide que esa degradación inhibiendo directamente la capacidad de estas enzimas digerir proteína y haciendo que la enzima sitios escote irreconocible.

Los dos principales mecanismos de fijación son Cross-linking y coagulación. Cross-linking consiste en formación de enlace covalente dentro de proteínas y entre ellos, que causa rigidez y por lo tanto resistir la degradación del tejido. La coagulación es causada por la deshidratación de las proteínas mediante el uso de alcohol o acetona, que deforman la estructura terciaria de la proteína, así que hidrofóbico, o agua temiendo, regiones mover la superficie de la proteína. Fijación de coagulante puede ayudar a incrustar los medios de comunicación, como la cera de parafina, penetrar en tejido.

Uno de los fijadores más comúnmente utilizadas es con formol, que es formaldehído disuelto en agua. Durante la fijación, el formaldehído se adhiere a aminas primarias, como las que se encuentran en las cadenas laterales de los aminoácidos lisina y glutamina para formar una reticulación estable llamada un puente methelene. Este proceso es intrínsecamente lento y puede tomar hasta 1-2 días.

Antes de la fijación deben hacerse algunas consideraciones. En primer lugar, considerar la difusividad de la muestra. Fijadores difundirán a distancia a través de los tejidos a una tasa que relaciona el coeficiente de difusión para el fijador multiplicado por la raíz cuadrada del tiempo. Un fijador que lleva 1 hora para penetrar 1 mm en la muestra tendrá 25 horas para penetrar 5 mm. Una vez que la formalina ha alcanzado el centro del tejido, el umbral de la reacción de reticulación necesita ocurrir. Por lo tanto, tamaño de muestra debe limitarse a 4 mm de espesor para la fijación exhaustiva en una cantidad razonable de tiempo.

En segundo lugar, tener en cuenta el volumen y el pH del fijador. El fijador al cociente del volumen de muestra debe ser por lo menos 40: 1 para que el reactivo no se agota fácilmente con el tiempo. Mientras algunos fijadores están diseñados para trabajar a un pH ácido, formol trabaja mejor cuando tamponados con fosfato para mantener un pH neutro, para que el exceso de ácido no se produce, que causa artefactos en el tejido.

El siguiente paso en la preparación histológica es inclusión, que consiste en apoyar las muestras en medios de comunicación que tiene rigidez mecánica similar a la muestra misma. Elegir el derecho de inclusión media es crítica, porque si es demasiado duro o demasiado débiles, defectos pueden ocurrir mientras el seccionamiento. Por el momento, los medios más comunes utilizados para empotrar son cera de parafina.

Antes de la inclusión en parafina, las muestras deben estar deshidratadas reemplazando el agua en el tejido con etanol, en primer lugar seguido de xilenos y entonces finalmente calentar cera de parafina. Una vez que la cera ha infiltrado en la muestra, cuidadosamente colocado y rodeada de cera adicional utilizando un molde para formar un bloque. A continuación, las muestras se unen a una cinta de tejido para seccionamiento.

Seccionamiento es el proceso de corte de lonchas finas de una muestra de un bloque de inclusión. Las secciones son generalmente del orden de 4-10 μm de espesor para uso con microscopía de luz.

Para cortar secciones, un metal, el vidrio o la hoja de diamante se fija primero en un micrótomo. La muestra se coloca en un porta muestra. A continuación, asciende a la superficie de corte y a través de la hoja para crear una rodaja del grosor deseado. Las secciones se amontona como cintas delgadas que pueden colocarse sobre el portaobjetos.

Siguientes secciones, las muestras se colocan en portaobjetos. Para las muestras de parafina incrustado, rodajas se colocan primero en un baño de agua caliente son levantadas fuera del agua sobre el portaobjetos y deja secar.

Tejido biológico tiene muy poco contraste inherente, así que después de la histología, diapositivas generalmente se tiñen con colorantes o anticuerpos que destacan morfología o proteínas específicas. La mancha más común realizada es hematoxilina y eosina, o H & E. Porque es tan común, muchas máquinas automáticas se han hecho para tinción reproducible numerosas secciones con H & E. hematoxilina tiñe los núcleos de las células azules y eosina tiñe el citoplasma rosado revelar la morfología celular de los tejidos.

Un inconveniente de fijación es que el cross-linking de proteínas puede hacer más para el etiquetado de anticuerpos para encontrar sus sitios de Unión. En lugar de utilizar fijación para preservar las muestras, rápidas congelación de los tejidos, o complemento de congelación puede ser utilizado, que es seguido por una técnica de seccionamiento llamada cryosectioning

Muestras de tejido son incrustadas y orientadas en un medios de congelación especiales llamados OCT o temperatura media óptima de corte y luego congeladas rápidamente. Como otro medio de inclusión, OCT coincide con la rigidez de la muestra.

Un cryomicrotome o criostato, se utiliza para cortar secciones congeladas y este instrumento mantiene una temperatura interna de-20 ° C para mantener la cuchilla y las muestras frescas. En contraste con secciones parafina-encajadas, secciones congeladas pueden izar directamente sobre un portaobjetos de vidrio cargada positivamente inmediatamente después del seccionamiento.

Otra forma de evitar la fijación es a través de agar incrustación, en el que las muestras se cubren con preparados agarosa líquida. Como la agarosa se enfría, que encaje el tejido y agarosa sobrante se puede recortar distancia.

Vibrotomes, otra alternativa para el micrótomo, tienen una cuchilla que vibra y se mueve a través de la muestra de agarosa incrustada. Vibrotomes se utilizan para crear secciones de espesor del orden de 50-1000 μm de agarosa incrustada muestras.

Muestras son típicamente de la agarosa antes de la tinción y luego coloca sobre un portaobjetos rodeado de una sustancia como la grasa para vacío que mantiene el cubreobjetos de aplastar la muestra. Ven mejor usando microscopia confocal para obtener imágenes de alta resolución de cada sección gruesa.

Sólo ha visto video de Zeus en la preparación de muestras histológicas para microscopía óptica.

Ahora debe comprender los pasos necesarios para la preparación de la muestra llegar de una pieza de tejido a una sección puede manchar. ¡Como siempre, gracias por ver!

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