Introducción a la microscopía de fluorescencia

General Laboratory Techniques
 

Summary

Microscopía de fluorescencia es una herramienta analítica muy poderosa que combina las propiedades de aumento de la microscopia ligera con la visualización de la fluorescencia. La fluorescencia es un fenómeno que implica la absorción y la emisión de una pequeña gama de ondas de luz por una molécula fluorescente conocida como un fluoróforo. Microscopía de fluorescencia se logra en conjunto con el microscopio óptico básico mediante la adición de una fuente de luz potente, filtros especializados y un medio de fluorescencia de etiquetado una muestra. Este video describe los principios básicos detrás de microscopía de fluorescencia como el mecanismo de fluorescencia, cambio el Stoke y photobleaching. También da ejemplos de las numerosas formas de fluorescencia una muestra incluyendo el uso de fluorescencia etiquetados anticuerpos y proteínas, ácidos nucleicos tintes fluorescentes con y la adición de proteínas naturalmente fluorescentes a una muestra de la etiqueta. Los principales componentes del microscopio de fluorescencia como una fuente de luz de xenón o mercurio, filtros de luz, espejo dicroico y uso de la persiana para iluminar la muestra están descritos. Por último, se muestran ejemplos de algunas de las muchas aplicaciones para microscopía de fluorescencia.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Técnicas generales de laboratorio. Introducción a la microscopía de fluorescencia. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La fluorescencia es un fenómeno que ocurre cuando una sustancia absorbe luz a una determinada longitud de onda y emite luz a otra longitud de onda. La fluorescencia se produce cuando un electrón, que ha sido excitado a un estado de energía más altos y más inestable, se relaja a su estado de tierra y emite un fotón de luz. La luz que se encarga de la excitación, o mover el electrón a un estado de mayor energía, es de menor longitud de onda y mayor energía que la emisión de fluorescencia, que tiene una longitud de onda más larga, menor energía y diverso color.

Microscopía de fluorescencia combina las propiedades de aumento del microscopio de luz con tecnología de fluorescencia que permite la excitación de- y la detección de las emisiones de fluoróforos - compuestos químicos fluorescentes. Con microscopía de fluorescencia, los científicos pueden observar la ubicación de tipos de células específicas dentro de tejidos o moléculas dentro de las células.

Los principales componentes del microscopio de fluorescencia se traslapan grandemente con el microscopio óptico tradicional. Sin embargo las 2 principales diferencias son el tipo de fuente de luz y el uso de los elementos filtrantes especializados.

Microscopía de fluorescencia requiere una fuente de luz muy potente como una lámpara de arco de xenón o mercurio como el que se muestra aquí. La luz emitida por la lámpara de arco de mercurio es de 10 - 100 veces más brillante que la mayoría de las lámparas incandescentes y proporciona una luz en una amplia gama de longitudes de onda del ultravioleta a los infrarrojos. Esta fuente de luz de alta potencia es la parte más peligrosa de la configuración del microscopio de fluorescencia como mirando directamente a la luz sin filtrar puede dañar sus retinas y mal manejo de los bulbos puede hacer que explote.

El fundamento de la microscopía de fluorescencia es simple. La luz sale de la lámpara de arco es dirigido a través de un filtro excitador, que selecciona la longitud de onda de excitación.

Esta luz es reflejada hacia la muestra por un espejo especial llamado un espejo dicroico, que está diseñado para reflejar la luz solamente en la longitud de onda de excitación. La luz reflejada pasa por el objetivo que se centra en la muestra fluorescente. Las emisiones de la muestra son a su vez, pasa hacia arriba a través del objetivo – donde se produce la ampliación de la imagen – y ahora a través del espejo dicroico.

Esta luz es filtrada por el filtro de la barrera, que selecciona la longitud de onda de emisión y filtra contaminantes luz de la lámpara de arco o de otras fuentes que se reflejan en los componentes del microscopio. Por último, la emisión fluorescente filtrada se envía a un detector, donde la imagen puede ser digitalizada, o se transmite en el ocular para la visión óptica.

El filtro excitador, espejo dicroico y filtro de barrera pueden ser reunidos en un componente conocido como el cubo de filtro. Cubos de filtro diferente pueden cambiar durante la muestra viendo para cambiar la longitud de onda de excitación, y una serie de connexión puede utilizarse para modificar la intensidad de la excitación.

Cuando se trata de realizar microscopía de fluorescencia, el fluoróforo puede ser tan importante como el microscopio de sí mismo, y el tipo de fluoróforo se va a examinar dicta la longitud de onda de excitación utilizado y la longitud de onda de emisión que se detecta. Las longitudes de onda de excitación contienen una pequeña gama de energías que puede ser absorbida por el fluoróforo y provocar su transición a un estado excitado. Una vez excitado, una amplia gama de emisiones, o las transiciones al estado inferior de energía, es posible dando por resultado un espectro de emisión.

La diferencia entre el pico de la absorción, o la curva de excitación y el pico de la curva de emisión se conoce como cambio de Stoke. Cuanto mayor sea la distancia en este cambio, más fácil es separar las dos longitudes de onda diferentes. Además, cualquier espectro superpuesto debe eliminarse por los componentes del cubo del filtro de fondo reducido y una calidad de imagen mejorada.

Exposición de fluoróforo excitación prolongada hará que se photobleach, que es un debilitamiento o pérdida de la fluorescencia. Para reducir el fotoblanqueo, puede Agregar un medio de montaje anti-fade a la diapositiva y sellar los bordes con esmalte de uñas. La diapositiva debe estar también en la oscuridad cuando no se va a examinar.

Para iniciar la proyección de imagen de fluorescencia, encienda la fuente de luz de xenón o mercurio y deje que se caliente durante 15 minutos a fin de alcanzar la iluminación constante.

A continuación, coloque la muestra en el escenario y asegúrelo en su lugar. Luego, encienda la fuente de luz blanca de su microscopio. Se centran en su muestra con el objetivo de menor potencia ajustando las perillas de enfoque grueso y fino. Continuación, utilice los botones de ajuste de fase para encontrar su área de interés.

A continuación, apague la fuente de luz blanca, así como todas las luces de sala innecesarios para reducir el fondo.

Selecciona el cubo de filtro adecuado para el tinte que es imagen y abra el obturador para iluminar la muestra.

Por último, hacer los ajustes de foco fino y dirigir la luz a la cámara de salida. Probable que necesite realizar ajustes en el tiempo de exposición para cada fluoróforo diferente o colorante fluorescente utilizado. Sin embargo, es importante mantener constante el tiempo de exposición al comparar las características con el mismo tinte en diferentes muestras.

Para colorantes múltiples en la misma muestra de la imagen, cambiar el cubo de filtro para coincidir con cada fluoróforo y grabar la nueva imagen.

Después de cada colorante en la muestra ha sido reflejada, imágenes individuales pueden ser overlaid y combinados.

Muchos tipos diferentes de experimentos pueden hacer uso de la microscopía fluorescente e implican a diferentes tipos de fluoróforos una de las aplicaciones más comunes de microscopia fluorescente es la proyección de imagen de proteínas que han sido marcados con anticuerpos que se unen o "conjugado" a compuestos fluorescentes... Aquí, un anticuerpo hacia proteínas superficiales leptoespiral fue detectado usando un anticuerpo secundario conjugado a alexafluor 488 que es verde cuando está excitado.

Otra forma de resaltar una característica específica con fluorescencia es integrar el código para una proteína fluorescente como la proteína verde fluorescente o GFP, en el ADN de un organismo. El gen de la GFP fue aislado originalmente de medusas y puede ser expresado o producido por cultivos de células en respuesta a desencadenantes específicos o como parte de un tipo de célula específica como el tumor de las células se muestra brillante en esta imagen

Otra aplicación de imágenes por fluorescencia es moteado de microscopía de fluorescencia que es una tecnología que utiliza fluorescencia etiquetada asambleas macromoleculares como la red de F-actina vistos aquí, al movimiento de estudio y cinética de la rotación de este importante proteínas citoesqueléticas.

Una técnica avanzada conocida como recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo o FRAP, se realiza por photobleaching intencionalmente una pequeña región de una muestra con el fin de controlar la tasa de difusión de moléculas fluorescente etiquetadas de nuevo en el photobleached región.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para microscopía de fluorescencia.

En este video que aprendimos el concepto de fluorescencia, como microscopía de fluorescencia difiere de microscopía de luz y cómo tomar una imagen de fluorescencia a través del colonoscopio. También hemos aprendido sobre algunas aplicaciones básicas y avanzadas que usan la fluorescencia. Gracias por ver y no olvidar al fotoblanqueo se ve gran en los dientes no es tan bueno para sus muestras.

This article is Free Access.

RECOMMEND JoVE

Applications