Introduction à la Microscopie de Fluorescence

General Laboratory Techniques
 

Summary

La microscopie de fluorescence est un outil d’analyse très puissant qui combine les propriétés grossissantes de la microscopie optique avec la visualisation de la fluorescence. La fluorescence est un phénomène qui implique l’absorbance et l’émission d’une petite gamme de longueurs d’ondes de la lumière par une molécule fluorescente appelée un fluorochrome. La microscopie de fluorescence est réalisée en conjonction avec le microscope optique de base par l’ajout d’une source lumineuse puissante, de filtres spécialisés, et d’un moyen de marquage par fluorescence des échantillons.

Cette vidéo décrit les principes de base derrière la microscopie de fluorescence incluant le mécanisme de fluorescence, le déplacement de Stokes, et le photoblanchiment. Elle donne aussi des exemples des nombreux moyens de marquage par fluorescence d’un échantillon incluant l’utilisation d’anticorps et de protéines marqués par fluorescence, de colorants d’acides nucléiques, et l’ajout de protéines naturellement fluorescentes à l’échantillon. Les composants principaux du microscope de fluorescence incluent une source de lumière au xénon ou au mercure, des filtres de lumière, un miroir semi-réfléchissant (miroir dichroïque), et l’utilisation de l’obturateur pour illuminer l’échantillon sont tous décrits. Finalement, des exemples de quelques utilisations de la microscopie de fluorescence sont montrés.

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JoVE Science Education Database. Les techniques générales de laboratoire. Introduction à la Microscopie de Fluorescence . JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La fluorescence est un phénomène qui prend place lorsqu’une substance absorbe la lumière à une longueur d’onde donnée et émet de la lumière à une autre longueur d’onde. La fluorescence apparait lorsqu’un électron, qui a été excité vers un état d’énergie plus haut et plus instable, redescend dans son état initial et émet un photon de lumière. La lumière qui est responsable de l’excitation, ou du déplacement de l’électron vers un niveau d’énergie supérieur, est de longueur d’onde plus courte et d’énergie plus haute que l’émission de fluorescence, qui a une longueur d’onde plus longue, une énergie plus faible et une couleur différente.

La microscopie de fluorescence mélange les propriétés grossissantes du microscope optique avec la technologie de fluorescence qui permet l’excitation et la détection des émissions de fluorochromes (des composés chimiques fluorescents). Avec la microscopie de fluorescence, les scientifiques peuvent observer la localisation de types spécifiques de cellules à l’intérieur de tissus, ou de molécules à l’intérieur de cellules.

Les composants principaux du microscope à fluorescence chevauchent considérablement ceux du microscope optique traditionnel. Cependant les deux différences principales sont le type de source lumineuse et l’utilisation d’éléments filtrants spécialisés.

La microscopie de fluorescence requiert une source de lumière très puissante, comme une lampe au xénon ou au mercure à arc comme celle montrée ici. La lumière émise par une lampe au mercure est 10 à 100 fois plus brillante que la plupart des lampes incandescentes, et fournit une lumière dans une large gamme de longueur d’ondes, de l’ultraviolet à l’infrarouge. Cette source de lumière a haute puissance est la partie la plus dangereuse du paramétrage du microscope de fluorescence, car regarder directement la lumière non filtrée peut causer de sérieux dommages à la rétine, et le mauvais traitement des ampoules peut provoquer leur explosion.

Le principe derrière la microscopie de fluorescence est simple. Lorsque la lumière quitte la lampe, elle est dirigée à travers un filtre excitateur, qui sélectionne la longueur d’onde d’excitation.

Cette lumière est réfléchie vers l’échantillon grâce à un miroir spécial appelé miroir dichroïque ou miroir semi-réfléchissant, qui est conçu pour réfléchir uniquement la lumière à la longueur d’onde d’excitation. La lumière réfléchie passe à travers l’objectif où elle est focalisée sur l’échantillon fluorescent. Les émissions de l’échantillon passent à leur tour à travers l’objectif – où l’agrandissement de l’image a lieu – et ensuite à travers le miroir dichroïque.

Cette lumière est filtrée par le filtre d’émission (ou filtre barrière), qui sélectionne la longueur d’onde d’émission, et filtre les faisceaux lumineux contaminants de la lampe ou d’autres sources qui sont réfléchies en dehors des composants du microscope. Finalement, l’émission fluorescente filtrée est envoyée vers un détecteur où l’image peut être numérisée, ou etre transmise à l’oculaire pour le visionnage optique.

Le filtre d’excitation, le miroir dichroïque, et le filtre d’émission peuvent être assemblés en un composant connu comme le cube filtrant. Différents cubes filtrants peuvent être inter-changés lors de l’observation d’un échantillon en vue de changer la longueur d’onde d’excitation, et une série de diaphragmes peut être utilisée pour modifier l’intensité de l’excitation.

Lorsqu’il s’agit d’effectuer une microscopie de fluorescence, le fluorochrome peut être aussi important que le microscope en lui-même, et le type de fluorochrome imagé dicte la longueur d’onde d’excitation utilisée et la longueur d’onde d’émission qui est détectée. La longueur d’onde d’excitation contient une petite gamme d’énergies qui peuvent être absorbées par le fluorochrome et provoquer sa transition vers un état excité. Une fois excité, une large gamme d’émissions, ou de transitions de retour au niveau d’énergie inférieur, peuvent résulter en un spectre d’émission.

La différence entre le pic d’absorption, ou courbe d’excitation, et le pic de la courbe d’émission est connu comme le déplacement de Stokes. Plus grande est la distance de ce déplacement, plus il est facile de séparer les deux longueurs d’ondes différentes. De plus, n’importe quel chevauchement de spectre nécessite d’être retiré par les composants du cube filtrant pour réduire le fond et améliorer la qualité de l’image.

L’exposition du fluorochrome à une excitation prolongée provoquera son photoblanchiment, qui est un affaiblissement ou une perte de fluorescence. Pour réduire le photoblanchiment, vous pouvez ajouter un milieu de montage anti-effacement à la lame et sceller les côtés avec du vernis à ongles. La lame devrait aussi être conservée dans le noir lorsqu’elle n’est pas visionnée.

Pour commencer une imagerie par fluorescence, allumez la source de lumière au xénon ou mercure et laissez la chauffer pendant 15 minutes en vue d’atteindre une illumination constante.

Ensuite, placez l’échantillon sur la platine et sécurisez-le en place. Maintenant, allumez la lumière blanche de votre microscope. Faites la mise au point sur l’échantillon en utilisant l’objectif de plus basse puissance, en pivotant les boutons de focus grossier et fin. Ensuite, utilisez les boutons d’ajustement de la platine pour trouver la zone d’intérêt.

Ensuite, éteignez la lumière blanche, ainsi que toute lumière de la pièce non nécessaire pour réduire le fond.

Sélectionnez le cube filtrant approprié pour le colorant que vous regardez et ouvrez l’obturateur pour illuminer l’échantillon.

Enfin, faites les ajustements de mise au point et dirigez la lumière sortante vers l’appareil photo d’imagerie. Vous aurez besoin d’ajuster le temps d’exposition pour chaque fluorochrome et coloration différents utilisés. Cependant, il est important de garder le temps d’exposition constant lors de la comparaison de caractéristiques sur différents échantillons avec la même coloration.

Pour imager les colorations multiples sur le même échantillon, changez le cube filtrant pour associer chaque fluorochrome à une nouvelle image et enregistrez la.

Après que chaque coloration de l’échantillon ait été imagée, les images individuelles peuvent être superposées et fondues.

Nombreux sont les types d’experiences qui peuvent faire usage de la microscopie de fluorescence, et impliquent différents types de fluorochromes. Une des utilisations les plus courantes est l’imagerie de protéines qui ont été marquées avec des anticorps qui sont attachés, ou « conjugués » à des composés fluorescents. Ici, un anticorps sur des protéine de surface leptospiral a été détecté en utilisant un anticorps secondaire, conjugué au Alexa Fluor, qui fluoresce vert lorsqu’il est excité.

Un autre moyen de mettre en évidence une caractéristique spécifique grace a la fluorescence est d’intégrer le code d’une protéine fluorescente comme la protéine fluorescente verte, ou GFP pour « Green Fluorescent Protein » en anglais, dans l’ADN de l’organisme. Le gène pour GFP était à l’origine isolé à partir de méduse et peut maintenant être exprimé, ou produit, par des cellules cultivées en réponse à une amorce spécifique, ou comme partie d’un type spécifique de cellules comme les cellules tumorales que vous voyez ici lumineuses.

Une autre utilisation de l’imagerie de fluorescence est la microscopie de fluorescence Speckle, qui est une technique qui utilise un assemblage de macromolécules marquées par fluorescence comme le réseau de F-actin montré ici, pour étudier le mouvement et le taux de renouvellement cinétique de cette importante protéine cytosquelettique.

Une technique avancée connue comme la fluorescence récupérée après photoblanchiment, ou FRAP pour « Fluorescence Recovery After Photobleaching », est effectuée par le photoblanchiment intentionnel d’une petite région d’un échantillon, en vue de surveiller le taux de diffusion des molécules marquées par fluorescence, de retour dans la région photoblanchie.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la Microscopie de Fluorescence. Dans cette vidéo nous avons vu le concept de fluorescence, comment la microscopie de fluorescence diffère de la microscopie optique, et comment prendre une image fluorescente à travers l’objectif. Nous avons aussi vu quelques applications de base et avancées qui utilisent la fluorescence. Merci de nous avoir regardé et n’oubliez pas que si le photoblanchiment est joli sur vos dents, ce n’est pas bon pour vos échantillons.

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