Introduction à la Microscopie Optique

General Laboratory Techniques

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Summary

Le microscope optique est un instrument utilisé par les chercheurs dans de nombreux domaines différents pour agrandir les échantillons jusqu’à autant que mille fois leur taille d’origine. Dans sa forme la plus simple, il est composé d’une lentille transparente qui agrandit l’objet et d’une source de lumière pour l’illuminer. Cependant, la plupart des microscopes optiques sont bien plus complexes et possèdent de nombreuses lentilles peaufinées avec des dimensions strictement contrôlées, tout cela à l’intérieur du corps du microscope dans les composants de l’objectif et de l’oculaire.

Dans cette vidéo, les composants majeurs du microscope optique sont décrits et leurs utilisations et fonctions sont expliquées en détails. Les principes de base de grossissement, mise au point, et résolution sont aussi introduits. Le fonctionnement du microscope optique de base commence par l’éclairage de l’échantillon et la vérification que la source de lumière est de la bonne intensité, direction, et forme en vue de produire la meilleure qualité d’image possible. Ensuite, l’échantillon doit être agrandit correctement et amené dans le champ de vision pour voir la région d’intérêt. Il y a beaucoup d’utilisations pratiques du microscope optique incluant le visionnage de cellules et de tissus tachés ou non, de petits détails d’échantillons, et même le grossissement d’une région d’intérêt lors d’une chirurgie pour aider aux procédures complexes à l’échelle du micron.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Les techniques générales de laboratoire. Introduction à la Microscopie Optique. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Le microscope optique est un instrument utilisé pour agrandir des prélèvements de recherche. Les microscopes optiques sont des outils d’analyse inestimables qui ont le potentiel de permettre aux chercheurs scientifiques de voir des objets à 1000 fois leur taille d’origine. Comme vous allez le voir, le microscope optique fonctionne via quelques principes très basiques mais a des utilisations presque sans limite pour visualiser des prélèvements au labo.

Le microscope optique – « Light Microscope » en anglais – requiert une source de lumière, qui produit la lumière qui peut être focalisée, par un condensateur, sur l’échantillon.

La lumière qui illumine l’échantillon atteint une lentille appelée lentille objet, qui crée une image agrandie qui est renversée, ou tournée la tête en bas. Un peu plus loin la lentille de l’oculaire agrandit l’image, image que l’oeil alors reçoit. Des éléments optiques additionnels peuvent être introduits dans le chemin des faisceaux lumineux en vue de redresser l’image, de manière à ce que l’oeil la voit dans la bonne orientation. Les microscopes qui utilisent de multiples lentilles comme celui que vous voyez ici sont appelés « microscopes composés ».

Dans un microscope composé, l’agrandissement total est calculé par la multiplication de l’agrandissement de la lentille de l’objectif par l’agrandissement de la lentille de l’oculaire. Avec une lentille objet de 40X et une lentille oculaire de 10X, l’agrandissement total est de 400X.

Pour aider à estimer la taille des objets sous le microscope, un réticule oculaire - une échelle qui est projetée au-dessus de l’image - peut être utilisé. A grossissement supérieur, les fines marques dans le réticule oculaire représenteront de plus petites distances que lorsqu’elles sont vues à un grossissement inférieur.

En plus du grossissement, un autre aspect du microscope optique est sa résolution. La résolution est la plus petite distance observable entre deux objets distincts par le microscope. Lorsque les têtes de ces personnages deviennent de plus en plus claires, et que la résolution augmente, la plus petite distance observable entre eux décroit.

Les composants principaux du microscope optique incluent les objectifs, les oculaires, l’étage de l’échantillon et le porte échantillon, la source de lumière, le champ du diaphragme, le condensateur et l’ouverture, et les roulettes de focalisation grossières ou fines.

Les objectifs sont responsables pour la majeure partie du grossissement et de la résolution du microscope. Ils sont montés sur un nez rotatif de sorte que lorsqu’ils sont échangés, le plan focal reste le même – on dit qu’ils sont parafocaux. Un objectif peut être marqué avec le grossissement, l’ouverture numérique ou N.A., le type de milieu d’immersion requis, l’épaisseur de la lamelle qui devrait être utilisée pour le montage d’échantillons, et la distance de travail – la distance à partir du bout de la lentille jusqu’au plan focal dans l’échantillon.

L’ouverture numérique, écrite N.A., est une mesure de la capacité de l’objectif du microscope à recueillir la lumière. Des objectifs à N.A. eleve permettent à la lumière oblique de passer à travers alors que des objectifs à bas N.A. peuvent seulement recueillir la lumière directe. La résolution d’un objectif peut être calculée à partir de l’ouverture numérique, sur base de la longueur d’onde de la lumière.

La source de lumière, le champ du diaphragme, l’ouverture, et le condensateur sont tous responsables pour la production et la mise en forme de la lumière qui est envoyée sur l’échantillon.

La source de lumière est typiquement une ampoule halogène à faible voltage qui peut être ajustée pour contrôler l’intensité de la lumière. La lumière passe alors à travers une grande variété de filtres et dans le champ du diaphragme, qui contrôle la surface de l’échantillon à illuminer.

Vient ensuite le condensateur, qui focalise la lumière sur l’échantillon, càd que le cône d’illumination autour de l’échantillon est contrôlé par lui et doit être ajusté en fonction de l’objectif qui est utilisé.

Pour commencer à utiliser un microscope optique, placez un échantillon contenant la région d’intérêt sur le plateau du microscope, centrez le directement sous l’objectif et sécurisez le en place en utilisant les pattes.

Ensuite, allumez la source lumineuse et changez l’objectif pour celui de la plus petite puissance.

Puis, focalisez l’objectif de petite puissance, en le déplaçant dans la direction des Z, en utilisant un ajustement initial avec le bouton de réglage grossier, puis faites tourner le bouton de réglage fin pour amener l’objet à une mise au point nette. Faites attention à ne pas cogner la lame avec l’objectif car cela pourrait endommager la lentille.

Ensuite, localisez la zone d’intérêt en regardant à travers l’oculaire tout en tournant les boutons pour déplacer la lame dans les directions de X et de Y. La taille du champ de vision diminuera drastiquement lorsque vous changerez d’un grossissement faible à un grossissement élevé. Centrer l’objectif de la plus petite puissance sur la zone d’intérêt avant de changer pour une puissance supérieure, augmente grandement les chances de trouver l’échantillon désiré.

Une fois que l’échantillon a été localisé à une puissance inférieure et que la mise au point est faite, passez à l’objectif de puissance supérieure qui sera utilisé pour l’acquisition des images.

Optimisez la qualité de l’éclairage en ajustant d’abord le champ du diaphragme de manière à ce que le diaphragme soit juste à l’extérieur du champ de vision.

Ensuite, ajustez le diaphragme du condensateur de façon à ce que le paramétrage corresponde à l’ouverture numérique de l’objectif utilisé.

Enfin, ajustez la focalisation à nouveau. Cette fois en utilisant uniquement le bouton de réglage fin.

Vous êtes maintenant prêt à prendre des images de votre échantillon.

La microscopie optique a le potentiel pour visualiser une large gamme de prélèvements, et il existe plusieurs configurations du microscope composé pour s’adapter à de nombreuses utilisations différentes.

Ici, vous voyez un chercheur préparant le travail sous un microscope chirurgical. Ces microscopes sont généralement suspendus sur un bras mobile et sont stéréoscopiques, ce qui signifie qu’ils permettent à la lumière de passer jusqu’au visionneur, et un appareil photo est aussi monté sur le microscope. Ce microscope chirurgical est utilisé dans une procédure de transplantation de rein, sur des souris.

Dans ce clip vidéo, vous voyez un chercheur regardant à travers un microscope à dissection, tout en sélectionnant la parfaite larve de drosophile pour une dissection en amont, en vue d’exposer les muscles de la paroi du corps afin d’étudier la jonction neuromusculaire.

Ici vous pouvez voir un microscope composé inversé, qui a un objectif en-dessous du plateau, étant préparé pour une technique de micro-injection. Cette procédure, appelée transfert nucléaire de cellules somatiques, est une méthode importante pour générer des animaux transgéniques et créer des clones.

Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la microscopie optique. Dans cette vidéo nous avons vu : ce qu’est un microscope et comment il fonctionne, ses composants, comment les régler, et comment acquérir des images de qualité. Merci de nous avoir regardé!

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