使用细胞计数板计数细胞

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

许多生物医学实验为了得到精确,可重复性,且有统计意义的数据,需要操作已知数目的细胞。因此,了解如何计数细胞是任何一个成功生物医学科学家要掌握的尤为关键的技术。计数细胞最常用的方法是使用细胞计数板-它是一种有两个激光蚀刻网格的工具,用来帮助在简单的光学显微镜下计数取样细胞。得到的数据可以用来推算出实验样品中细胞的数目。

本短片将演示:如何调整实验样品浓度避免计数过多或过少的细胞;如何使用细胞计数板来计数微量(10μl) 细胞样品;如何判断选择使用细胞计数板网格中的哪个方格进行计数;如何根据所选用计数的方格来计算实验样品中细胞的总数目;以及如何用台盼蓝拒染法测定实验细胞的存活率。此外,短片还讨论了几种实验条件下必须了解准确细胞数目,包括一个使用自动细胞计数仪的例子。

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JoVE Science Education Database. 细胞分子生物学中的基本方法. 使用细胞计数板计数细胞. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

细胞计数是许多细胞实验中的一个重要步骤,用来确定细胞的数量和存活率。通常情况下,计数的目的是为了知道如何稀释未知细胞浓度的样品来进行下一步实验。实验室中最常用的细胞计数工具是细胞计数板。

细胞计数板最初是为了计数血细胞而设计的。在细胞计数板的中央有两个细胞计数池。上面有激光蚀刻形成的网格。

网格由9个主要方格构成。角上的四个方格每一个被进一步分成16个较小的方格。中央的主要方格被分为25个较小的方格,每一个较小方格被进一步分为16个微型方格。

在每个细胞计数池的远端是上样口,待计数的细胞样品从此处加入。

在细胞计数池的另外两边,是盖玻片的支架,用于支撑盖玻片。支架通常高于细胞计数池约0.1毫米。

因为每个大方格的面积是1个平方毫米,所以每个大方格的体积0.1立方毫米,或者说是万分之一毫升。

每次计数之前,都要用酒精和无尘布来清洁擦去细胞计数池和盖玻片上的纤维、指纹或者水印。

然后小心地向每个盖玻片支架上加少量的水,水的表面张力将使盖玻片固定不动。

再轻轻打散细胞悬浮液,或用移液器上下吹吸来打散任何存在的细胞团。

使用微量移液器吸取10微升细胞悬浮液加到上样口。悬液通过毛细作用进入细胞计数池,并将填满整个网格。

在等待细胞静置下来的过程中,选择好物镜,然后将细胞计数板放入显微镜的载物台。

在显微镜下观察细胞。如果每个大方格内少于5个细胞,就需将样品重新离心,用更小的体积重悬细胞;如果细胞有相互重叠,或者因密度太大难以区分,就需再次稀释样品到更大的体积。要记住这个稀释倍数,因为后面的计算将要用到它。

现在开始计数细胞!

正如我们以前所说,细胞计数池表面是激光侵蚀的网格。格线会方便记录你要计数的细胞。计数的时候是根据样品中细胞的密度来决定选取的方格的大小。例如,如果细胞数量较少,那就计数一个角落方格中的所有细胞。如果细胞数量适中,那就选择16个较小方格中的一个。如果细胞密度很高,就计数中央25个小方格中的一个。无论选择哪种方格进行计数,每个方格中至少都要有20-50个细胞来计数。

不是所有的细胞都会恰好落在方格之内。这时你可以计数那些接触到顶部和左侧的边线的细胞,而忽略那些接触底部和右侧边线的细胞。为得到最准确的计数,使用细胞计数器记录细胞数目,并计算四个同样大小方格内的平均细胞数。

要计算1毫升体积中的细胞数目,将平均细胞数乘以10000,因为如前所述,网格中的大方格体积是万分之一毫升。如果您计数的是这些大方格中的一个,就乘1;如果您计数的是较小的方格,就乘16;如果您计数的是25个中央方格中的一个,那就乘25;如果细胞悬浮液在上样前稀释过,您还需要乘上稀释倍数。

这里,为了计算1毫升样品中的细胞数目,我们要将在中央方格计数的20个细胞乘以104再乘以25,得到1毫升样品中的细胞总数为 5x106。

知道了1毫升中细胞的总数,我们需要再乘以样品的总体积。例如,每毫升细胞数是5x106,那么2毫升样品中的细胞总数将是1x107。

接下来,为了避免计数错误、细胞分布不均匀或者取样误差,可以在另一侧的细胞计数池再次计数细胞。

在显微镜下计数细胞的同时也可以测定样品中细胞的存活率。因此在样品上样到细胞计数板前,通常都将样品与一种重要的染料台盼蓝混合。

活细胞无法吸收这种染料,因为活细胞能选择进入他们细胞膜的物质。而死细胞不会有紧密的细胞膜,从而台盼蓝会进入细胞将其染色。

当要检验细胞样品的存活率时,先将部分细胞悬液稀释到台盼蓝中,然后同操作普通细胞样品一样,将其上样到细胞计数板。在相差显微镜下,活细胞会发亮,呈金色,这样的细胞将被计数。不要计数任何灰暗,死亡,蓝色的细胞。

和前面演示的一样计算细胞数目,但是这次要乘以在台盼蓝中的稀释倍数。例如在上个例子中,如果我们的细胞已经在台盼蓝中稀释过10倍,那么我们需要将结果再乘以10,最后的细胞总数就应该是1x108。

细胞计数完成后,要记住清洁盖玻片和细胞计数池。

现在您已经是细胞计数专家了,让我们再来讲讲在某些特定实验中我们需要知道确切细胞数目的一些原因。

从正常或实验组织中分离细胞后,知道得到细胞的数目非常重要。这里,研究人员想知道他们从这个小鼠肾脏中分离到了多少脾细胞和肾细胞。

当您进行实验来观察两种不同细胞群的反应时,知道混合的每种细胞类型的细胞数目就很重要,比如这个用B细胞和T细胞混合培养的实验。

在许多其他类型的细胞实验中,您也会需要知道实验中的细胞数目。这里是一个ELISPOT实验,用来测定在被人类乳突病毒侵染后,样品中有多少细胞能够释放IFNr炎症蛋白。

当操作实验从目的细胞中提取或分离mRNA时,为确保获得实验所需足够量的mRNA,知道所用细胞的数目很重要。

细胞计数板是一种价格低廉且相对易于操作的细胞计数工具,但是由于操作过程单调可能会引起人为错误。

Scepter手持式自动细胞计数仪,正如其名字所指,是一种手持的计数设备,它比细胞计数板的计数精度更高,并且能够区分出样品中细胞大小和体积的不同。

TC10 自动细胞计数仪,则能同时测定细胞数量和存活率,并且自动计算出样品中的细胞数,它还可以将细胞显示在显示屏幕上。

您刚观看的是JoVE对细胞计数的介绍。本短片中,我们讲解了什么是细胞计数板,如何计数细胞并测定细胞存活率,以及需要计数细胞的一些不同原因。 感谢您的观看,记住,不要计数蓝色细胞哦!

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