Overview
Muchos experimentos biomédicos requieren manipulación de una cantidad conocida de células, con el fin de lograr exactos, reproducibles y los datos estadísticamente relevantes. Por lo tanto, aprender a contar las células es una técnica indispensable para cualquier éxito científico biomédico. La forma más común para contar las células es mediante un hemacitómetro - un instrumento que lleva dos rejillas grabado a láser, que ayudan a la enumeración de una alícuota células bajo un microscopio simple de luz. Esta información puede utilizarse entonces para extrapolar el número de células en la muestra experimental.
Este video le mostrará cómo: ajustar la concentración de la muestra experimental por lo que no intenta contar demasiadas o demasiado pocas células; Cómo utilizar un hemacitómetro para contar una alícuota de pequeño (~ 10 μl) de las células; Cómo determinar qué cuadrante de la red de láser hemacitómetro para contar; Cómo calcular el número total de células en la muestra experimental, dependiendo de qué cuadrante fue utilizado; y cómo determinar la viabilidad de la población de la célula experimental mediante exclusión del azul tripán. Además, varias situaciones experimentales que confiable y precisa determinación del número de células es necesario, incluyendo un ejemplo usando un contador de células automatizado, también se discuten.
Procedure
Conteo de células es un paso importante en muchas células-ensayos para determinar la viabilidad y número de células. En general, el objetivo de contar es entender cuánto una muestra de una concentración desconocida de la célula debe diluirse para su uso posterior. La herramienta más común de laboratorio para el conteo de las células es el hemacitómetro.
El hemacitómetro es una herramienta cuenta que fue creada originalmente para el recuento de células sanguíneas. En el centro del hemacitómetro son dos cámaras de conteo, en que un laser grabado al agua fuerte se puede encontrar red.
La red se compone de 9 cuadrantes principales. Los cuadrantes de cuatro esquinas se dividen en 16 cuadrantes más pequeños. El cuadrante central se divide en 25 de estos cuadrantes más pequeños, cada uno de los cuales todavía se divide en 16 micro-cuadrantes.
En el extremo de cada cámara son puertos de introducción de muestra, en el cual se distribuye la muestra de células para ser contado.
A cada lado de las cámaras de recuentos son el cubreobjetos, soporte, sobre las que el cubreobjetos de cuarzo descansa, generalmente de 0,1 mm por encima de la cámara de conteo.
Desde el área de cada cuadrado grande es 1 mm2, el volumen contenido en cada cuadrado grande es 0,1 mm3 o 1/10.000 de un ml.
Antes de contar, siempre tome un momento para usar etanol y un kimwipe para limpiar y secar a pelusa, las huellas o marcas de agua del cubreobjetos y la cámara de conteo.
Añada cuidadosamente una pequeña cantidad de agua a cada uno de lo cubreobjetos, soporte, la tensión superficial del agua llevará a cabo el cubreobjetos en lugar.
Ahora suavemente triturate la suspensión de células, o pipeta hacia arriba y hacia abajo para liberar cualquier celular matas. Utilice una micropipeta para aspirar 10 μl de la suspensión y luego cargar uno de los puertos de introducción con la muestra. La solución se sorteará en la cámara de conteo por acción capilar y debe cubrir la red entera.
Mientras que las células se colocar, seleccione el objetivo. Luego cargar el hemacitómetro en el escenario.
A continuación ve las células bajo el microscopio. Si hay menos de 5 células en cada uno de los cuadrantes grandes, necesitará girar su muestra abajo otra vez y resuspender el precipitado en un volumen más pequeño. Si las células se solapan entre sí o son simplemente demasiado densos para distinguir fácilmente entre sí, puede que necesite diluir la muestra en un volumen mayor de solución. Asegúrese de hacer un seguimiento del factor con el cual están diluyendo las células. Usted necesitará en un cálculo posterior.
¡Ahora es el momento para contar las células!
Como hemos hablado anteriormente, la cámara de conteo está cubierta en una cuadrícula de grabado a láser. Las líneas de los cuadrantes que sea más fácil hacer un seguimiento de las células que está contando. Elegir el cuadrante de tamaño para contar dependiendo de la densidad de las células de su muestra. Por ejemplo, si hay un número bajo de células, contar todas las celdas de uno de los cuadrantes de la esquina. Para las muestras con una cantidad media de células, elija uno de los 16 cuadrantes más pequeños. Si hay una muy alta densidad de células, contar las células en uno de los cuadrantes centrales 25. No importa de que cuadrante eliges o la densidad de la muestra de células, contar por lo menos 20-50 células por superoderecho.
No todas las células caen perfectamente dentro de los cuadrantes. Usted puede contar las células que tocan las líneas superior e izquierdas, pero ignoran los que tocar la parte inferior o derecha unos. Para obtener el recuento más preciso, utilice un contador de células para hacer un seguimiento de las células y tomar la media del número de células en 4 cuadrantes del mismo tamaño.
Para calcular el número de células en un volumen de 1 ml, multiplica el número de células contadas por 10.000, porque, como lo mencionamos antes, cada gran plaza en la parrilla de 1/10.000 de un ml. Si ha contado uno de estos cuadrantes más grandes, simplemente multiplique a este número 1. Si ha contado una de las plazas más pequeñas en uno de los cuadrantes de la esquina, multiplique a este número por 16. Si se cuentan todas las células en uno de los cuadrantes centrales 25, multiplique a este número por 25. Si usted sucedió a diluir su suspensión antes de cargar el hemacyotmeter, también necesitará multiplicar por el factor de dilución.
Entonces, para calcular el número de células en 1 ml de esta muestra, se multiplicarían las 20 células en este cuadrante central 104 y 25 para un total de 5 x 106 células en 1 ml de la muestra.
Ahora que sabemos que el número total de células en 1 ml de la muestra, tenemos que multiplicar a este número por el volumen total de nuestra solución. Por ejemplo, si tenemos 5 x 106 células en 1 ml, 2 ml, tendremos un total de 1 x 107 células.
Entonces, para evitar errores de miscounting, distribución desigual de las células, o los errores de pipeteo, al otro lado de la cámara de carga y contar su muestra de célula una segunda vez.
Conteo de las células bajo el microscopio también es un buen momento para evaluar la viabilidad de las células de su muestra. Tripán azul, un colorante vital, a menudo se mezcla con la muestra antes de ser cargado en el hemacitómetro para este propósito.
Células vivas excluyen este tinte, ya que las células vivas son muy selectivas acerca de lo que permiten a través de sus membranas. Una célula muerta, sin embargo, tienen una membrana intacta, que permite el trypan azul pase a través y tinción del citoplasma.
Para comprobar la viabilidad de su muestra de células, diluir una alícuota de la suspensión celular en trypan azul y luego cargar la muestra teñida de azul tripán al igual que la muestra celular regular. Bajo el contraste de fase, las células vivas aparecerán brillante y dorada y deben ser contadas; no cuentan ninguna de las células embotadas, muertas, azul.
Calcular el número de células como antes, multiplicando al número por el factor de dilución de azul de tripano. Así que si nuestra muestra representativa original primero había sido diluida en trypan azul, luego habría multiplicado nuestro número total de células por el 1:10 dilución de azul de tripano, para un total de 1 x 108 células en nuestra muestra.
Cuando hayas acabado contando, no olvide limpiar el cubreobjetos y la cámara de conteo.
Ahora que eres una célula cuenta pro, vamos a hablar de algunos de los motivos que necesites para saber cuántas células tiene en un experimento particular.
Después de aislar células de un tejido normal o experimental, es importante saber cuántas células has recuperado. Aquí los investigadores querrán saber cuántos esplenocitos, o células de bazo, han aislado de este bazo de ratón.
Cuando esté realizando un experimento para ver cómo dos diferentes poblaciones celulares reaccionan, es importante saber cuántos de cada tipo de célula están mezclando, como en esta cultura Co el experimento con B y T las células.
Se desea saber cuántas células tienen muchos otros tipos de ensayos de célula. Aquí un análisis ELISPOT se está estableciendo para determinar el número de células en una muestra que se secretan IFNγ, una proteína inflamatoria, en respuesta al virus del papiloma humano.
Al realizar un experimento en el cual mRNA debe ser extraído o aisladas, de las células de interés, es importante saber cuántas llamadas vas a empezar, con el fin de adquirir una cantidad suficiente de mRNA para el experimento.
El hemacitómetro es una herramienta barata y relativamente fácil de usar para el recuento de células, pero puede ser tedioso y tiene el potencial para error humano.
El cetro contador automático portátil es, como su nombre indica, una mano llevado a cabo contando el dispositivo que tiene una precisión de conteo mejoradora comparada con el hemacitómetro y que puede discriminar el tamaño y el volumen de las células en una muestra de células.
El contador de células automatizado TC10 evalúa el numero de celular y viabilidad, automáticamente calcula el número total de células en la muestra y permite a las células ser visto en su pantalla de lectura así.
Sólo ha visto introducción de Zeus a la cuenta del celular. En este video repasamos: es lo que un hemacitómetro, cómo contar las células y determinar la viabilidad celular, y algunas de las razones diferentes necesitará contar células. Gracias por ver y no olvide contar las células azules.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
