Culture cellulaire de base: passages des cellules

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

Les lignées cellulaires sont fréquemment utilisées dans des expériences biomédicales, car la croissance et l’expansion rapide de plusieurs types de cellules permettent l'analyse expérimentale accélérée. Les lignées cellulaires sont cultivées dans des conditions similaires par rapport à des cellules fraîchement isolées, ou primaires, mais avec quelques différences importantes de base : (i) des lignées cellulaires exigent un mélange de facteurs de croissance spécifique et (ii) leur croissance doivent être suivi de plus près que pour des cellules primaires , parce que les mutations qui leur permettent d' être cultivées indéfiniment peuvent aussi très brusquement conduire à leur prolifération trop rapide. Par conséquent, quand une lignée de cellules atteint le point de croissance ou la culture recouvre la majeure partie du récipient de culture, ou une confluence de 90%, les cellules doivent être collectées, lavées, utilisées expérimentalement, congelées pour une utilisation ultérieure, ou remise en culture pour l'expansion dans de nouveaux récipients de culture.

Cette vidéo va vous montrer comment utiliser des indicateurs de milieux pour déterminer la santé de la culture cellulaire, quels produits et équipement sont utiles pour collecter en toute sécurité des lignées de cellules adhérentes, et diverses méthodes de transfert de ces cellules pour une expansion robuste dans de nouvelles cultures seront discutés. Des méthodes sur la façon de cultiver des cellules nourricières (importantes pour fournir des facteurs de croissance essentiels à des lignées cellulaires) et sur la façon de développer un grand nombre de cellules rapidement.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Méthodes de base en biologie cellulaire et moléculaire. Culture cellulaire de base: passages des cellules. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

Le passage, ou sous-culture de cellules, est une procédure commune dans laquelle les cellules d'une culture donnée sont divisées, ou en anglais "split", dans de nouvelles cultures et nourries avec du milieu frais pour faciliter l'expansion. Bien que le concept lui-même soit relativement simple, dans cette vidéo, nous allons discuter des étapes les plus importantes pour le maintien et l'expansion réussie de lignées cellulaires.

Des métabolites toxiques s'accumulent dans le milieu de culture des cellules au fil du temps. Lors de l'expansion des cellules, il est particulièrement important de changer régulièrement le milieu de culture afin de maintenir la cellule en santé et pour contrôler l'expansion cellulaire afin d’éviter le surdéveloppement.

En général, deux principaux types de cellules sont développés: des lignées cellulaires immortalisées et des lignées de cellules souches

Les lignées cellulaires immortalisées sont des cellules qui sont dérivées d'organismes multicellulaires qui ont connu un certain type de mutation affectant la régulation de leur cycle cellulaire, ce qui leur permet de proliférer indéfiniment. La lignée immortalisée la plus célèbre est peut-être la lignée cellulaire HeLa, qui a été dérivée d’un cancer du col de l'utérus isolé d’une biopsie prélevée de Mme Henrietta Lacks en 1951.

Par contraste avec les lignées cellulaires immortalisées par le cancer, les lignées de cellules souches sont générées par l'isolement de cellules pluripotentes qui se renouvellent naturellement et qui se retrouvent dans une variété de tissus embryonnaires et adultes. Sous de bonnes conditions, ces cellules, comme les cellules souches embryonnaires humaines que vous voyez ici, peuvent être maintenues en culture indéfiniment.

Les cellules sont soit cultivées de manière optimale en suspension, comme des cellules immortalisées isolées à partir du sang, ou alors elles se développent mieux quand elles adhèrent à une surface, comme c'est souvent le cas pour de nombreuses cellules dérivées de tissus.

La croissance des cellules adhérentes doit être étroitement surveillée pour assurer la santé des cellules. Selon le type de cellules, la plupart des cellules adhérentes doivent être divisées lorsqu'elles sont confluentes à 70-90%, c'est à dire quand elles couvrent 70 à 90% de la surface du contenant de culture.

Garder à l'esprit que les lignées cellulaires conservent de nombreuses caractéristiques de la culture de cellules d'origine, mais à chaque passage successif, elles peuvent également commencer à acquérir des caractéristiques uniques de la culture grandissante. Par conséquent, envisagez de limiter le nombre de passages d'une lignée cellulaire.

Lors du passage des cellules, il est important d'utiliser une technique stérile, ainsi que les produits et l’équipement appropriés.

Il est essentiel d'utiliser le milieu approprié pour la croissance optimale et l'expansion de votre lignée cellulaire. Chaque lignée cellulaire exigera un mélange de supplément de croissance spécifique, cependant, la plupart des lignées de cellules nécessitent au minimum une complémentation comme celle-ci: du sérum, tel que du sérum bovin fœtal, qui doit être traitée thermiquement afin d'inactiver le complément et qui fournit des facteurs de croissance essentiels pour les cellules, des antibiotiques, comme la pénicilline et de la streptomycine, qui limite la contamination bactérienne, et d'autres facteurs de croissance, comme le facteur de croissance fibroblastique, pour aider à prolonger la croissance et l'expansion des lignées cellulaires. Rangez les milieux de culture et le milieu complet avec supplément, à 4° C lorsque vous n'utilisez pas.

D'abord, prenez note de la couleur du milieu de culture. Un milieu frais est riche en nutriments et apparait orange clair, en partie due à l'ajout de l'indicateur de pH, le rouge de phénol.

Quand les cellules commencent à épuiser les éléments nutritifs dans le milieu, les déchets incluant des métabolites acides commencent à s'accumuler dans la culture cellulaire, ce qui résulte en l'abaissement du pH. Pour cette raison, de nombreux milieux de culture contiennent le rouge de phénol, qui change le milieu de culture de l'orange au jaune lorsque les cellules tournent la culture acide. Changer les milieux avant qu'il ne devienne cette couleur!

Lorsque le rouge de phénol change le milieu en une couleur rosâtre, cela indique que le pH est devenu trop basique pour la croissance de cellules saines, il peut être temps de changer votre réservoir de CO2 ainsi que vos milieux.

La plupart des lignées cellulaires adhérentes s’attachent naturellement au plastique. Par conséquent, des plaques de culture de cellules en plastique, comme les boîtes de Pétri ou des plaques à 6 puits, sont fréquemment utilisés pour la sous-culture des cellules.

Des flacons de culture cellulaire en plastique sont également utilisés. Le flacon de culture T25, par exemple, est souvent utilisé pour cultiver de petites populations de cellules ou pour démarrer la croissance d'une lignée cellulaire qui croit lentement. Des flacons de culture T75 sont couramment utilisés pour des lignées cellulaires qui prolifèrent plus rapidement ou pour générer un nombre de cellules que ne pourrait pas contenir un flacon T25.

Lors de la collection des cellules adhérentes, les protéines qui lient les cellules au plastique doivent d'abord être coupées. A cet effet, la trypsine, une enzyme digestive est souvent utilisée. Il est important de chronométrer soigneusement l'exposition à la trypsine, car un trop long traitement peut entrainer des dommages à d'autres protéines à la surface des cellules.

Les milieux de culture cellulaire peuvent contenir des produits qui neutralisent la trypsine. Par conséquent, un tampon phosphate salin, appellé PBS en anglais, est souvent utilisé pour laver les cellules avant le traitement à la trypsine.

L’EDTA, un chélateur de calcium, est parfois également utilisé pour améliorer la fonction protéolytique de la trypsine.

Pour la culture d’une souche de cellules, les cellules fraichement divisées sont cultivées dans un incubateur de culture cellulaire dans des conditions adaptées a cette lignée cellulaire, typiquement à environ 37° C, 5% CO2 et 95% d'humidité.

Maintenant, nous allons diviser des cellules!

Avant de commencer, il est important de savoir à quelle fréquence vos cellules doivent être surveillées, ce qui dépend de la vitesse à laquelle ces cellules prolifèrent.

Maintenant que votre média est d’une couleur orange saine, portez attention à d’autres conditions de culture, à savoir si la culture est trouble - ce qui pourrait indiquer une contamination -, la taille et la densité des colonies de cellules, et la qualité globale des cellules.

Si les cellules ont atteint environ 90% de confluence, retirer le milieu de culture et laver les cellules avec du PBS sans calcium ni magnésium.

Maintenant, ajoutez la trypsine aux cellules et incuber à 37 °C. Après environ 5 minutes, confirmez que les cellules sont détachées, puis arrêter la protéolyse en ajoutant du milieu de culture frais.

Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de centrifugation. Puis, après la centrifugation, retirez délicatement le surnageant sans déranger le culot et remettez en suspension les cellules dans un milieu frais. Comptez le nombre de cellules que vous avez recueillies, puis ensemencez les cellules en fonction de la densité appropriée, pour l'expansion immédiate ou ultérieure.

Maintenant que vous savez comment diviser les cellules, regardons quelques différentes applications de la méthode.

Comme mentionné précédemment, les cellules souches embryonnaires humaines sont un type de cellule qui doit être soumis à des passages. Ils sont généralement co-cultivées avec des fibroblastes embryonnaires de souris, ou MEF, qui fournissent des facteurs qui aident les cellules souches a conserver leur état pluripotent.

Les colonies de cellules souches cultivées sur des cellules nourricières doivent être collectées une fois qu'elles ont atteint le stade approprié de développement. Elles peuvent être choisies par micropipette ou par raclage doux avec un outil de cueillette de verre puis étalées dans une nouvelle culture pour l’expansion.

Certaines lignées cellulaires sont sensibles à la digestion enzymatique ou bien sont si fortement adhérentes qu’elles ne peuvent pas être remises en suspension avec le seul traitement à la trypsine. Un racleur de cellules peut être utilisé pour doucement collecter les cellules à partir du bas du contenant de culture. Si les cellules sont particulièrement adhérentes, essayez de déplacer une pipette sérologique, dans un mouvement de raclage, tout en rinçant le fond du récipient avec le milieu ou toute autre solution appropriée. Faites attention avec cette méthode, car les cellules délicates peuvent être endommagées par cette méthode mécanique de dissociation.

Pour cultiver plus rapidement, et démultiplier les résultats de la culture de cellules, mettre les cellules dans un contenant muni de plusieurs surfaces d’adhésion, ce qui peut accroitre la croissance cellulaire 3 à 5 fois par rapport aux flacons à couche unique.

Vous venez de regarder l'introduction au passage de cellules présenté par JoVE. Dans cette vidéo, nous avons examiné ce qu’est une lignée cellulaire, comment diviser les cellules, et différentes façons de cultiver des cellules. Merci de votre attention, et n'oubliez pas de garder vos médias frais!

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