Electrophorèse d'ADN sur gel

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Summary

L'électrophorèse d'ADN sur gel est une technique utilisée pour la détection et la séparation des molécules d'ADN. Un champ électrique est appliqué à une matrice de gel constituée d'agarose, et à l'intérieur du gel, les particules chargées vont migrer et seront séparées sur base de leur taille. Les phosphates du squelette de l'ADN négativement chargés provoquent le mouvement des fragments d'ADN vers l'anode – l'électrode chargée positivement.

La vidéo explique le mécanisme via lequel les fragments d'ADN sont déterminés dans un gel d'agarose, et elle fournit une procédure généralisée pas à pas montrant comment préparer les gels d'agarose, charger les échantillons d'ADN, exécuter un gel d'ADN, visualiser les fragments d'ADN, et jeter correctement le gel et le tampon d'exécution après que l'expérimentaiton soit finie.

Cite this Video

JoVE Science Education Database. Méthodes de base en biologie cellulaire et moléculaire. Electrophorèse d'ADN sur gel. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

L'Electrophorèse d'ADN sur gel est une technique utilisée pour séparer et identifier les fragments d'ADN en fonction de leur taille.

Les fragments d'ADN de tailles variées sont chargés dans un gel poreux fait à partir d'agarose – un hydrate de carbone trouvé dans les algues rouges.

Lorsqu'un champ électrique est appliqué, les fragments vont migrer à travers le gel, grâce à la charge négative des groupes phosphates dans les nucléotides de l'ADN.

Les plus petits morceaux d'ADN vont plus facilement migrer à travers le gel que les fragments plus large, qui ont un temps de déplacement plus long à travers la matrice du gel.

Lorsque l'exécution sur le gel est finie, la localisation de vos échantillons d'ADN peut être comparée à une série de fragments ou de bandes de tailles connues, appelées échelles d'ADN.

La présence de votre fragment d'intérêt peut alors être confirmée sur la base de sa taille, qui est déterminée en comparant la localisation relative de votre échantillon de test aux fragments de l'échelle.

Les gels d'agarose sont préparés en utilisant une solution dont le pourcentage est en poids sur le volume. Donc 1 gramme d'agarose dans 100 mL de tampon donnera un gel à 1 %. Les gels à pourcentage inférieur vont permettre de déterminer les fragments plus grands, et les gels à pourcentage supérieur vont rendre les fragments plus petits plus facile à identifier. Pour commencer la procédure de conception du gel, pesez la masse appropriée d'agarose dans un flacon Erlenmeyer.

Ajoutez un tampon d'exécution au flacon, de telle sorte que le volume de tampon ne soit pas plus grand qu'un tiers de la capacité du flacon. Ensuite faites tourbillonner pour mélanger.

Faites fondre le mélange agarose/tampon en chauffant dans un micro-ondes à la puissance maximale. Toutes les 30 secondes, retirez le flacon et tourbillonnez le contenu pour bien mélanger. Répétez jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissous.

Ensuite, ajoutez du bromure d'éthidium jusqu'à une concentration de 0,5 mg/ml. Le bromure d'éthidium est un composé aromatique qui rentre, ou s'intercale, entre les paires de base individuelles d'ADN, et pousse l'ADN à émettre une fluorescence orange intense sous lampe UV. Il est important de noter que le bromure d'éthidium est une substance cancérogène, donc des gants doivent toujours être portés lors de la prise en main de gels contenant ce composé.

Pour prévenir le plateau de gel de la déformation, laissez l'agarose se refroidir en le plaçant dans un bain d'eau chaude à 65 °C.

Pendant que l'agarose se refroidit, preparez le moule du gel en plaçant le plateau de gel dans l'appareil de distribution. Comme alternative, vous pouvez utiliser du papier collant pour colmater les bords ouverts du plateau de gel pour créer le moule. Placez un peigne dans le gel qui va creer les puits où l'ADN est chargé. Soyez sûr que le peigne va créer un puit de la taille appropriée pour votre échantillon d'ADN.

Versez l'agarose fondu dans le moule de gel et permettez lui de durcir à température ambiante.

Après que l'agarose ait durci, retirez le peigne. Si le gel n'est pas utilisé immédiatement, emballez le dans une enveloppe en plastique et stockez le à 4 °C jusqu'à son utilisation.

Si le gel est utilisé tout de suite, placez le dans la boite à gel.

Pour commencer cette procédure, ajoutez du colorant (du gel de chargement) aux échantillons d'ADN afin de les séparer. Le colorant de chargement est typiquement fait à une concentration de 6X. Le colorant de chargement aide à visualiser et charger les échantillons dans les puits et aide à déterminer la distance à laquelle les échantillons ont migrés lors de l'exécution.

Réglez la source de courant au voltage désiré.

Maintenant, ajoutez assez de tampon d'exécution dans la boite à gel pour couvrir la surface du gel. Soyez sûr d'utiliser le même tampon d'exécution que celui utilisé pour préparer le gel.

Connectez les plombs de la boite de gel à la source de courant et mettez la en marche. Souvenez-vous que l'ADN est négativement chargé et va se déplacer vers l'anode, qui est positive, et généralement de couleur rouge. Soyez sûr de ne pas connecter la tête noire, ou cathode, au fond de la boite de gel. Aussi n'oubliez pas, les chats noirs sont de mauvaise augure, ou négatif, et que la CAThode noire est donc négative. Exécutez votre gel à la borne rouge, c'est-à-dire à l'anode. Pour vérifier que la boite à gel et la source de courant fonctionnent, l'apparition de bulles aux électrodes indique que le courant passe à travers.

Retirez le couvercle de la boite de gel. Lentement et précautionneusement chargez les échantillons d'ADN dans le gel. A nouveau, le colorant de chargement mis dans l'échantillon permet à l'échantillon de couler dans le gel et permettra de suivre dans quelle mesure l'échantillon a voyagé. Un marqueur des tailles d'ADN, ou échelle, devrait toujours être chargé avec les échantillons expérimentaux.

Remettez le couvercle. Vérifiez que les électrodes sont branchées dans les fentes appropriees sur la source de courant.

Allumez le courant. Exécutez le gel jusqu'à ce que le colorant ait migré à une distance appropriée.

Lorsque l'exécution de l'électrophorèse est finie, éteignez la source de courant et retirez le couvercle de la boite de gel.

Retirez le gel de la boite et égouttez l'excès de tampon de la surface du gel. Placez le plateau de gel sur de l'essuie-tout pour absorber tout tampon restant.

Pour visualiser les fragments d'ADN, retirez le gel du plateau de gel et exposez le à la lampe UV.

Le fragment d'ADN devrait apparaitre comme des bandes fluorescentes orange. Prenez une photo du gel.

A la fin de l'expérimentation, jetez correctement le gel et le tampon d'exécution selon les régulations institutionnelles. A nouveau, souvenez-vous de toujours tenir le gel et les tampons avec des gants pour éviter l'exposition au bromure d'éthidium.

Maintenant que vous avez vu comment réaliser une électrophorèse d'ADN sur gel, regardons quelques utilisations en aval et certaines variations de cette méthode hautement utile.

Ici, vous voyez le résultat d'une électrophorèse sur gel d'agarose après séparation des produits de PCR. Les fragments d'ADN chargés dans le gel sont visibles sous forme de bandes clairement définies. L'ADN standard ou échelle devrait être séparé à un degré qui permet la détermination utile de la dimension des bandes d'échantillons. Dans cet exemple, les fragments d'ADN de 765 paires de bases, 880 paires de bases et 1022 paires de bases sont séparées sur un gel d'agarose à 1,5 % avec une échelle d'ADN 2-log.

En complément pour confirmer la présence d'un fragment d'ADN d'intérêt, l'électrophorèse d'ADN sur gel peut être combinée avec les procédures de purification sur gel. Typiquement, une lame de rasoir est utilisée pour couper le fragment d'ADN d'intérêt, de telle sorte qu’il puisse être collecté et que l'échantillon d'ADN soit récupéré à l'intérieur.

L'électrophorèse sur gel d'agarose peut aussi être combinée avec l'immunotransfert, qui implique d'autoriser l'ADN, ou ARN, à se transférer à une membrane de cellulose, où des tests radioactifs peuvent être utilisés pour identifier les séquences spécifiques d'ADN ou ARN dans votre échantillon séparé par électrophorèse.

L'électrophorèse standard d'ADN sur gel n'est pas idéale pour la séparation d'ADN de haut poids moléculaire supérieur à 15-20 kilobase en taille, tel que l'ADN génomique. Pour séparer des échantillons de grands ADN, l'électrophorèse sur gel en champ pulsé est utilisée, ce qui implique de soumettre le gel à un champ électrique changeant, ou pulsant, dans différentes directions. Cette technique implique un équipement spécialisé, qui comprend une paire d'électrodes, déployées dans différentes orientations autour du gel. Ceci peut être utilisé pour détecter des différences dans les tailles de génomes entre des populations d'organismes, comme dans ce groupement d'échantillons d'ADN originaires de différentes communautés microbiennes que vous voyez ici et qui sont tirées de différents lacs.

Vous venez de regarder une introduction à l'électrophorèse d'ADN sur gel. Nous vous avons montré le concept derrière la méthode, comment préparer le gel d'agarose, comment charger vos échantillons, comment exécuter et analyser le gel ainsi que quelques utilisations communes de l'électrophorèse sur gel d'agarose. Merci pour votre attention et bonne chance avec l'exécution de votre gel!

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