Transformation bactérienne: la méthode du Choc Thermique

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology
 

Summary

La transformation est un processus qui apparait lorsqu'une cellule ingère un ADN étranger depuis son entourage. La transformation peut se produire dans la nature dans certains types de bactérie. En biologie moléculaire, la transformation est reproduite artificiellement au labo via la création de pores dans les membranes des cellules bactériennes. Les cellules bactériennes qui sont capables de prendre l'ADN depuis l'environnement sont appelées cellules compétentes. Au laboratoire, les cellules bactériennes peuvent être rendues compétentes et l'ADN peut par la suite être introduit par une procédure appelée méthode du choc thermique.

La transformation par choc thermique utilise un environnement riche en calcium fournit par du chlorure de calcium pour contrer la répulsion électrostatique entre l'ADN plasmidique et la membrane cellulaire bactérienne. Une augmentation soudaine en température crée des pores dans la membrane plasmique de la bactérie et autorise l'ADN plasmidique à entrer dans la cellule bactérienne. Cette vidéo passe en revue une procédure pas à pas sur comment créer des bactéries chimiquement compétentes, réaliser une transformation par choc thermique, mettre en plaque les bactéries transformées, et calculer l'efficacité de la transformation.

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JoVE Science Education Database. Méthodes de base en biologie cellulaire et moléculaire. Transformation bactérienne: la méthode du Choc Thermique. JoVE, Cambridge, MA, (2017).

La transformation bactérienne est une méthode largement utilisée dans laquelle de l'ADN étranger est introduit à l'intérieur d'une bactérie, qui peut alors mutliplier, ou cloner l'ADN. Les cellules qui ont la capacité de prendre rapidement cet ADN sont appelées cellules compétentes. Bien que la transformation se produit naturellement dans plusieurs types de bactéries, les scientifiques ont trouvé des moyens pour induire et améliorer artificiellement la compétence des cellules bactériennes. Dans cette vidéo nous allons parler de l'un de ces moyens, la transformation par choc thermique.

Avant de parler de la technique par choc thermique, abordons le type d'ADN le plus couramment utilisé dans la transformation bactérienne: le plasmide. Un plasmide est un ADN double-brin petit et circulaire, qui peut réduire sa taille par superenroulement, afin de passer facilement à travers les pores de la membrane cellullaire.

Un plasmide contient quelques régions importantes qui valent la peine d'être mentionnées. Les plasmides disponibles dans le commerce contiennent des sites multiple de clonage ou MCS (Multiple Cloning Site en anglais). Cette région contient des séquences spécifiques reconnues par les endonucléases de restriction ou enzymes de restriction, qui fendent l'ADN. Les fragments d'ADN d'intérêt pour les chercheurs peuvent être insérés dans les multiple sites de clonage quand le plasmide et le fragment d'ADN sont coupés avec les mêmes endonucléases.

Les plasmides contiennent aussi une Origine de Réplication, ou ORI, qui fournit aux cellules l’endroit ou la réplication du plasmide doit commencer.

En plus de l'origine de réplication et des sites multiple de clonage, la plupart des plasmides incluent un gène de résistance aux antibiotiques. Ce gène procure une résistance aux antibiotiques à toutes les cellules qui contiennent ce plasmide, autorisant ces cellules à survivre dans un milieu contenant des antibiotiques.

Maintenant que nous avons parlé des plasmides, parlons des cellules dans lesquelles ils vont être introduit: les cellules compétentes. Le type de bactérie le plus couramment utilisé dans la recherche en biologie moléculaire et en transformation est E. coli, qui vit dans votre intestin grêle. Ces cellules sont typiquement rendues compétentes via l'exposition à un environnement riche en calcium.

Les charges positives des ions calcium neutralisent les charges négatives du plasmide et de la paroi de la cellule bactérienne, dissipant la répulsion électrostatique et affaiblissant la paroi cellulaire.

En exposant les cellules à une augmentation soudaine de température, ou un choc thermique, une différence de pression entre l'extérieur et l'intérieur de la cellule est créée, ce qui induit la formation de pores, au travers desquels l'ADN plasmidique supercoloïdal peut entrer. Après le retour des cellules à une température normale, la paroi de la cellule se cicatrisera d’elle-même.

Une fois que les cellules ont absorbé les plasmides, elles vont être capable de croître sur des plaques de gélose avec antibiotiques.

Avant de commencer la transformation par choc thermique, nettoyez la zone de travail et vérifiez que tous les équipements soient stérilisés.

Assurez-vous que vous avez assez de milieu et de gélose préparés, car ils fournissent la nourriture aux bactéries que vous allez rendre compétentes. Stérilisez egalement toutes les solutions par autoclave. Permettez aux milieux liquides de refroidir à température ambiante avant utilisation et laissez la gélose reposer de 50 à 55 °C, température à laquelle les antibiotiques peuvent être ajoutés et les plaques remplies.

Lors du travail avec des bactéries, toujours utiliser une technique aseptisée pour maintenir la stérilité. Une technique aseptique implique typiquement l'utilisation d'un bec Bunsen pour stériliser les instruments et réactifs et créer un courant de convection – qui garde les contaminants en suspension dans l'air hors du champ de travail.

Juste avant la réaction de choc thermique, préchauffez votre milieu à température ambiante et les plaques de gélose LB contenant les antibiotiques à 37°C. Vérifiez aussi que l'eau de votre bain est à 42°C.

Ensuite, dégellez les cellules chimiquement compétentes sur glace.

Ajoutez 1 à 5μL de plasmide froid à 1ng/μL aux cellules bactériennes, mélangez gentiment, et remettez la solution de cellules et de plasmides dans la glace pendant 30 minutes.

Lorsque le temps est écoulé, soumettez la solution de cellules et de plasmides au choc thermique en la plaçant dans un bain d'eau chaude à 42°C pendant 30 secondes.

Immédiatement après avoir retiré le tube du bain d'eau chaude mettez le dans la glace et ajoutez 450μl de milieu. Placez le ensuite dans un incubateur à agitation à 37°C pendant 1 heure à plus de 225 rpm (tour par minute) de manière à ce que les cellules puissent récupérer.

En utilisant une technique aseptique appropriée, ajoutez 20 à 200μL de bactéries dans une plaque de gélose LB et répandez les bactéries tout autour avec un épandeur à bactéries. Incubez les plaques pendant la nuit à 37°C, le couvercle retourné, pour empêcher l'exposition des bactéries à la condensation.

Le jour suivant, les bactéries qui ont pris les plasmides auront formé des colonies.

Ensuite, comptez les colonies pour calculer l'efficacité de transformation, a savoir le nombre de transformés avec succès divisé par le nombre total d'ADN présent.

Maintenant, les colonies peuvent être sélectionnées pour des expérimentations plus poussées.

Avant d'être rendues compétentes, les bactéries utilisées en transformation sont stockées dans le congélateur. Elles doivent être dégelées dans la glace, répandues sur une plaque de gélose – sans antibiotiques, et laissées croitre pendant la nuit à 37°C.

En utilisant une technique aseptique, sélectionnez une colonie bactérienne de la plaque de gélose et faites la grandir dans une culture plus grande de 500 ml pendant la nuit à 37°C dans un incubateur à agitation – un instrument qui empêche la sédimentation des bactéries et disperse les nutriments dans le milieu.

Pendant que les cellules grandissent préparez les solutions de 0,1 mole de chlorure de calcium et 0,1 mole de chlorure de calcium plus 15% de glycérol, mettez les à l'autoclave puis laissez reposer.

Des mesures d'absorbance sont utilisées pour déterminer si oui ou non les bactéries sont dans leur phase de croissance mi-log, ce qui signifie qu'elles vont rapidement prendre l'ADN. Une fois que les cellules ont atteint cette phase, placez les dans la glace et gardez les a cet endroit tout au long de la procédure.

Ensuite, séparez les cellules bactériennes dans deux larges tubes centrifuges et centrifugez les à 4°C. Retirez le supernageant et remettez en suspension dans environ 100 ml de 0,1 mole de chlorure de calcium froid. Ensuite, incubez les cellules dans la glace pendant 30 minutes. Cette étape est répetée au minimum une fois. Les cycles de centrifugation et de resuspension des cellules sont souvent référencés comme le lavage de vos cellules.

Après le dernier lavage, remettez les cellules en suspension dans 50ml de solution de chlorure de calcium à 0,1 mole et 15% de glycérol. Ces cellules sont maintenant chimiquement compétentes.

Distribuez 50 μl de bactéries dans plusieurs microtubes et stockez les à -80°C jusqu'à ce qu’ils soient prêt pour le choc thermique.

Il existe de nombreuses utilisations et variations de transformations bactériennes.

En plus du choc thermique, l'électroporation est une autre technique commune pour la transformation. Comme son nom l'indique l'électroporation implique l'utilisation d'électricité pour créer des pores dans la membrane de la cellule bactérienne au travers desquels l'ADN peut passer.

En ce qui concerne la détection des bactéries transformées, les plasmides contiennent souvent un gène codant l'enzyme bêta-galactosidase pour aider au scannage. Lorsque le substrat de cet enzyme est inclu dans les plaques de gélose, les bactéries qui ont été transformées avec les plasmides contiennent un insert les rendant blanches, alors que celles qui n'incluent pas de plasmides, deviennent des colonies bleues. Cette méthode est référencée comme la détection bleue et blanche.

Dans la plupart des expérimentations de transformation, le but est d'obtenir rapidement des bactéries qui se divisent pour obtenir une grande quantité de plasmide, ce qui inclut votre gène cible. Juste après la transformation bactérienne, l'étape suivante est de faire proliférer un grand nombre de bactéries dans un milieu liquide contenant des antibiotiques et réaliser la purification plasmidique, qui, comme son nom le suggère, implique la purification des plasmides hors des bactéries. Il existe beaucoup de kits commercialises dans ce but.

Parfois la transformation a pour but la generation par les bacteries d’un grand nombre de protéines codées par le plasmide. Ici, vous voyez des cellules bactériennes être homogénéisées et lysées, avant qu'une technique appelée purification par affinité puisse être réalisée pour isoler la protéine cible. Après la purification d'une grande quantité de la protéine, elle peut alors être cristallisée, et la structure de la protéine d'intérêt particulière peut être identifiée.

Vous venez de regarder l'introduction de JoVE sur les transformations par choc thermique. Dans cette vidéo nous avons vu: ce qu'est la transformation par choc thermique et comment elle fonctionne, le principe sous-jacent et comment transformer avec succès des bactéries. Merci de nous avoir regardé!

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